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纤维素酶(Cellulase)酶系通常由3种酶组成的复合酶系,包括外切葡聚糖酶(CBH)、内切葡聚糖酶(EG)和β-葡萄糖苷酶(BGL),是一种降解p-1,4糖苷键生成寡糖的酶系。在纤维素酶水解过程中,外切葡聚糖酶主要降解纤维素的结晶区,内切葡聚糖酶主要降解非结晶区,β-葡萄糖苷酶降解纤维二糖和纤维寡糖,3种酶之间通过协同作用把纤维素生成葡萄糖。论文以匍枝根霉(Rhizopus stolonifer TP-02)为研究对象,从匍枝根霉中克隆cbhl和cbh2基因,并在E.coli BL21中表达,对重组蛋白进行纯化研究,并对其酶学特性进行分析。并通过软件预测外切葡聚糖酶CBHI和CBHII的结构与功能,分析其与底物结合催化作用机制和关键作用位点。主要研究结果如下：(1)以Rhizopus stolonifer TP-02基因组DNA和逆转录合成的cDNA为模板,通过PCR扩增获得外切葡聚糖酶基因(cbh1、cbh2)、cbhl基因全长1578 bp,编码536个氨基酸,属于GH7家族;cbh2 DNA通过测序编码1647 bp,cbh2 DNA中含有3个内含子,cbh2编码440个氨基酸,属于GH6家族。利用Discover Studio 2.5对CBHI进行同源建模分析,在催化区域内,CBHI的活性部位被loop覆盖,形成一个“桶状”的隧道结构,隧道中的Glu213、Glu218、Trp41残基在水解底物的过程中具有重要的作用。对CBHII进行同源建模分析,CBHII在与底物结合过程中,催化隧道中的关键氨基酸Arg179,Trp371,Lys399和His418对底物产生了明显的氢键作用。(2)将去除信号肽的cbhl、cbh2基因与pET22b载体连接,转化到E.coli BL21(DE3)中,通过刚果红染色法筛选高产阳性克隆子,获得E.coli BL21(DE3)/pET22b-cbh1和E.coli BL21(DE3)/pET22b-cbh2重组菌。通过优化发酵条件,E.coli BL21(DE3)/pET22b-cbh1重组菌在LB培养基中发酵,在IPTG终浓度为0.5 mmol/L,诱导温度为20℃,诱导时间14h时酶活为0.61 IU/mL; E.coli BL21(DE3)/pET22b-cbh2重组菌在LB培养基中发酵,IPTG终浓度为0.2 mmol/L,诱导温度为25℃,诱导时间14h时酶活力为0.78 IU/mL。(3)通过发酵,对CBHI和CBHII进行纯化。CBHI采用亲和层析和离子交换层析进行纯化,获得56 kDa的蛋白,比活力为3.57 IU/mg。通过酶特性研究发现,CBHI最适反应温度和pH分别为55℃和5.5,在pH 4.5-6.5的范围内稳定性较好,Fe3+和CO2+对其具有较强的激活作用；以微晶纤维素为底物,Km值为6.1 mg·mL-1。CBHII采用亲和层析、离子交换层析和G75层析,获得46 kDa的蛋白,比活力为4.67 IU/mg,通过研究CBHII酶的基本特性,CBHII在50℃、pH为5.0的条件下酶活最高,且在pH 4-7下具有好的稳定性,Fe2+和Co2+对CBHII具有激活作用,在65℃以下CBHII的热稳定性较好,Km为7.257 mg·mL-1。本研究从匍枝根霉中分离cbh1、cbh2基因,经过同源模拟分析发现,CBHI的结构与哈茨木霉、里氏木霉CBHI的催化活性隧道中含有的关键氨基酸残基一样,且在隧道的入口处含有一个Trp41与纤维六糖发生明显的氢键作用。CBHⅡ的结构与里氏木霉、斜卧青霉CBHⅡ的隧道中含有关键的氨基酸残基一样,且在隧道中Arg179、 Trp371、Lys399、His418与纤维六糖也有明显的氢键作用。结合克隆表达和蛋白分离纯化技术研究酶的基本特性发现,CBHⅠ具有较宽的pH稳定性,CBHⅡ较里氏木霉CBHⅡ具有耐热性,为进一步的深入研究匍枝根霉纤维素酶提供了理论基础。