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削弱N-钙粘蛋白介导的粘附连接对离体大鼠心脏缝隙连接分布及心律失常发生的影响摘要背景:缝隙连接、粘附连接和桥粒都位于闰盘内,共同发挥维持心肌细胞的电-机械偶联作用。正常的机械偶联和电偶联是心肌维持正常电活动的基础。越来越多的研究表明一些与机械连接蛋白病变有关的疾病以及某些模型动物易发生室性心律失常和猝死,并且与缝隙连接的重构密切相关。但目前细胞间粘附作用对缝隙连接的直接影响和因此产生的致心律失常作用还有待于进一步阐明。目的:采用特异性阻断N-钙粘蛋白粘附功能的合成多肽——AHAVD阻断培养的大鼠心肌细胞和离体大鼠心脏N-钙粘蛋白介导的细胞间粘附作用,研究急性削弱心肌细胞间粘附作用对缝隙连接的分布及功能的影响,并进一步研究N-钙粘蛋白介导的粘附连接损伤对离体灌流大鼠心脏心律失常诱发率的影响。方法和结果:本系列研究分为三部分:第一部分培养的心肌细胞经0.2mM AHAVD和0.2 mM IPPINL(一种含有钙粘蛋白中高保守序列的无义多肽)处理1小时,通过免疫荧光标记发现AHAVD可迅速削弱细胞间粘附作用,同时伴有Cx43的分布改变;用荧光黄传导试验检测发现AHAVD与IPPINL处理组1小时和对照组细胞相比间缝隙连接的通讯功能明显下降(荧光黄扩散距离分别为:0.25±0.09mm,0.74±0.23mm和0.83±0.26mm;P<0.05)。而Western-blot分析结果显示N-钙粘蛋白和Cx43的总量并没有显著改变。第二部分56只离体成年大鼠心脏随机分为三组进行Langendorff灌注,分别以氧饱和的含AHAVD(0.2 mM,n=18)、IPPINL(0.2 mM,n=18)的K-H液和氧饱和的K-H液(n=20)灌流1小时,通过电镜在AHAVD灌流的心脏可观察到粘附连接的分离;免疫荧光定量显示闰盘内Cx43的减少和沿心肌细胞侧边分布增多,AHAVD灌流组心肌闰盘内代表缝隙连接的Cx43的相对荧光数量比IPPINL灌流和K-H液灌流组相对减少(分别为46±11.3%,69±19.5%和72±18.2%;P<0.01)而N-钙粘蛋白/连环蛋白复合体并没有显著改变。荧光黄传导试验检测发现AHAVD灌流的大鼠心脏心肌细胞间通讯功能明显下降(荧光黄和罗丹明葡聚糖在心肌组织中扩散的差异度分别为1.37±0.33,2.84±0.78和2.83±0.65;P<0.05)。第三部分通过右室心尖部程序电刺激和心外膜单向动作电位描记等方法研究AHAVD对灌流大鼠心脏电生理特性的影响,发现AHAVD灌流的大鼠心脏心律失常诱发率显著增高(分别为50%,22.2%和15%;P<0.05),同时伴有心肌传导速度显著减慢(分别53.5±6.3cm/s,65.2±6.2cm/s和66.3±8.8cm/s;P<0.05)。而对灌流心脏的心外膜动作电位的分析结果显示各组灌流后ERP、APD90并没有显著差异。结论:用AHAVD灌流削弱N-钙粘蛋白的粘附功能短时间内不减少Cx43的总量,但可迅速引起Cx43的重新分布,心肌组织闰盘内的Cx43显著减少,心肌细胞通讯功能下降,左室心肌的传导速度下降,同时增加灌流心脏的心律失常诱发率。以上实验结果,显示削弱N-钙粘蛋白的粘附功能可能通过影响缝隙连接的功能增加心律失常发生的易感性。