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2007年,在加拿大首次报告了 A型塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）,有感染猪群的情况,随后在美国、巴西、哥伦比亚、中国、泰国、越南均有相关报道。2015年,广东某猪场分离出一株SVA,从而确定了 SVA在我国的流行,SVA在我国的流行给养猪产业带来了巨大的经济损失。目前,我国境内存在许多亚临床感染现象,并且缺乏获批的商品化疫苗可以使用,这种情况增加了我国对A型塞内卡病毒病的防控难度。因此,需要开发一种具有高安全性的SVA新型疫苗。本研究目的是建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并且将其运用于SVA的检测;使用原核表达系统来表达纯化SVA VP1与SVA VP3的重组蛋白,将纯化复性后的SVA VP1与SVA VP3蛋白与佐剂联合免疫小鼠,对小鼠免疫效果进行评估。结果如下:1.SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立:SVA 2C基因标准品的拷贝数在1.99× 107-1.99× 100copies/μL范围内。2C基因标准品的相关系数为0.994,其斜率为3.736,2C检测方法的灵敏性为1.99×100,高于普通PCR 10000倍,2C组间变异系数在0.76～0.93%之间,组内变异系数在0.35～0.66%之间;SVA 3D基因标准品的拷贝数在2.18 × 107-2.18 × 100 copies/μ L范围内,3D基因标准品的相关系数为1.000,其斜率为3.589;3D检测方法灵敏性为2.18 × 100拷贝/μ L,高于普通PCR 1000倍;3D组间变异系数在0.60～1.06%之间,组内变异系数在0.51～0.89%之间;两种基因构建的检测方法均具有良好的特异性,SVA与PCV2、PCV3、FMDV、PRRSV、PEDV、TGEV均不产生交叉反应。采用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测了 49份样品,2C检测出阳性率81.6%、3D检测出阳性率85.7%,使用普通PCR方法检测出的阳性率为55.1%。表明建立的SVA SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR较普通PCR方法,具有更高的敏感性与更强的特异性,可以考虑用于SVA的快速检测。2.原核表达SVA VP1蛋白与VP3蛋白:扩增SVA VP1与VP3目的基因片段分别为792bp与717bp,与预期相符;并将SVA VP1与VP3克隆至pET-28a载体,然后,成功构建了 pET-28a-VP1重组质粒和pET-28a-VP3重组质粒,转化至E.coli BL21（DE3）pLySs感受态,再经IPTG诱导表达,分别约35KDa、29KDa的目的蛋白;温度为37℃,0.8mmol/L为诱导剂浓度、4h为诱导时间时,VP1蛋白表达量最高。温度为37℃,1.Ommol/L为诱导剂浓度、6h为诱导时间时,VP3蛋白表达量最高。这两种重组蛋白均是呈现包涵体形式。用His标签Ni2+-NTA金属螯合蛋白质纯化柱纯化蛋白,薄层扫描结果显示VP1重组蛋白与VP3重组蛋白是纯度分别为85%、84%。3.SVA VP1及VP3蛋白联合佐剂小鼠免疫评价:使用VP1浓度为0.56mg/mL、VP3浓度为0.23mg/mL的蛋白,联合氢氧化铝佐剂与弗式佐剂进行小鼠免疫试验,小鼠试验组的免疫抗原剂量是50 μ g/只,其中进行腿部肌肉注射,每只100 μL,首次免疫14d后,进行第二次免疫。并且分别从体液免疫与细胞免疫对小鼠的免疫效果进行评估。结果表明,VP1亚单位疫苗各免疫组的特异性抗体一免后7d均呈上升趋势,于二免后14d时VP1-FCA组特异性抗体效价达到最高值（1:163840）;于二免后14d时VP1-AL组特异性抗体效价达到最高值（1:5120）;中和抗体效价在二免后7d时极显著高于PBS组,VP1-FCA组达到最高值（1:512）,在二免后14d时VP1-AL组达到最高值（1:1024）;小鼠T淋巴细胞亚群CD3+CD4+与CD3+CD8+在二免后VP1-FCA组显著升高（p<0.05）,VP1-AL组极显著升高（p<0.01）;淋巴细胞增殖实验表明VP1-AL组与VP1-FCA组均呈现显著升高（p<0.05）;对免疫小鼠血清中细胞因子检测结果表明IL-4的分泌显著升高（p<0.05）,IL-2与IFN-γ的变化不明显。VP3亚单位疫苗各免疫组组的特异性抗体一免后7d均呈上升趋势,于二免后14d时,VP3-FCA组特异性的抗体效价,已经达到最高值为（1:163840）。VP3-AL组特异性的抗体效价,已经达到最高值为（1:81920）;中和抗体在二免后7d时,效价极显著高于PBS组,在二免后14d,VP3-AL组与VP3-FCA组同时达到最高值,分别是（1:128）、（1:32）;淋巴细胞增殖实验表明VP3-AL组与VP3-FCA组均呈现显著升高趋势（p<0.05）;然后对免疫小鼠血清中含有的细胞因子进行检测,检测结果表明:细胞因子IL-4的分泌显著提高（p<0.05）,IL-2与IFN-γ产生的变化不明显。本研究利用SVA VP1重组蛋白联合佐剂AL组是可诱导小鼠体内产生免疫应答且效果良好,为该抗原后续猪体免疫研究奠定了基础。