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产肉性能是肉鸡生产最有经济意义的性状之一,围绕该性状已经开展了大量的研究工作。目前,已经成功定位到多个数量性状座位(QTL)和差异表达基因与体重和肌肉的生长表型显著相关。但是,对位于 QTL区间的致因性突变的挖掘和主效基因的功能调控机制的研究仍然不十分清楚。本论文基于前期利用全基因组关联分析(GWAS)的方法进行肉鸡生长和产肉性状定位的结果,选取QTL区间内的miR-16作为影响生长和肌肉沉积的主效候选基因进行群体遗传效应分析和功能基因组学研究,重点解析miR-16基因表达差异的分子调控机制和miR-16控制肉鸡骨骼肌生长发育过程中的调控通路。主要研究结果如下:
(1)miR-16基因的前体序列上游145bp处存在54bp的插入突变,且该插入单元具有典型的发夹茎环结构。由于54bp的插入突变引入新的选择性剪切位点,导致成熟miR-16的剪切过程被特异性的抑制,从而下调miR-16的表达。
(2)利用杏花鸡和隐性白羽洛克肉鸡杂交所构建的F2资源家系群体进行miR-16变异的遗传效应分析,结果表明54bp插入突变与肉鸡的体重、胸肌重和腿肌重均极显著关联,且插入型突变为优势等位基因。利用驯化程度不同的群体进行 miR-16插入型等位基因的基因频率分析,结果表明商业肉鸡品种与其他品种间的分化程度较高(Fst>0.3)。
(3)过表达miR-16抑制成肌细胞的增殖过程,同对照组相比,将成肌细胞阻滞于G1期的细胞比例上调10%。同时,过表达 miR-16促进成肌细胞的凋亡,使早期和晚期凋亡细胞的比例显著上调。
(4)miR-16可以通过与Bcl2和FOXO1基因3’UTR互作,在mRNA和蛋白水平上抑制Bcl2的表达,而仅在蛋白水平抑制FOXO1的表达。类似于miR-16过表达对肌肉细胞生长的调控作用,特异性抑制Bcl2和FOXO1均可以抑制成肌细胞的增殖和促进其凋亡。
(5)在肌肉细胞中抑制FOXO1可以调控1655个基因的差异表达(Fold change>2, FDR<0.05),占整个基因组的13%,其中包括4个显著下调(MyoG、MEF2C、MYL1和MYF5)和2个显著上调(Myo5C和Myo5B)的肌肉生成相关的调控因子。对这些差异基因进行功能富集分析,FOXO1可以调控多个信号通路,包括 ERK5和AMPK信号通路,来促进肌肉分化和肌纤维的形成。
(6)通过整合分析PI3K抑制剂和FOXO1抑制剂对成肌细胞的转录调控变化,发现有114个基因受到PI3K-FOXO1通路的调控作用,包括BCL2A1、CDKN2B和PDK4。
(7)整合分析FOXO1的靶向结合基因组区域和 FOXO1诱导的差异表达基因,发现24个基因被FOXO1的直接靶向转录调控,其中7个基因受到FOXO1的负向调控,17个基因受到FOXO1的正向调控。
(8)FOXO1通过下调MYH7B和上调MYH1B和MYH1D来促进慢肌纤维向快肌纤维转换。PI3K可以通过FOXO1来上调MYH7B的表达,而以不依赖FOXO1的方式上调MYH1D的表达。
综上所述,本研究利用功能基因组学和群体遗传效应分析发现54bp插入突变是导致 miR-16表达水平和调控功能差异的致因性突变。一方面,短片段的插入突变通过引入新的剪切位点而特异性抑制miR-16的表达生成;另一方面,miR-16可以通过靶向抑制Bcl2和FOXO1及FOXO1介导的信号通路来抑制肌肉细胞增殖和分化,促进肌肉细胞的凋亡。
(1)miR-16基因的前体序列上游145bp处存在54bp的插入突变,且该插入单元具有典型的发夹茎环结构。由于54bp的插入突变引入新的选择性剪切位点,导致成熟miR-16的剪切过程被特异性的抑制,从而下调miR-16的表达。
(2)利用杏花鸡和隐性白羽洛克肉鸡杂交所构建的F2资源家系群体进行miR-16变异的遗传效应分析,结果表明54bp插入突变与肉鸡的体重、胸肌重和腿肌重均极显著关联,且插入型突变为优势等位基因。利用驯化程度不同的群体进行 miR-16插入型等位基因的基因频率分析,结果表明商业肉鸡品种与其他品种间的分化程度较高(Fst>0.3)。
(3)过表达miR-16抑制成肌细胞的增殖过程,同对照组相比,将成肌细胞阻滞于G1期的细胞比例上调10%。同时,过表达 miR-16促进成肌细胞的凋亡,使早期和晚期凋亡细胞的比例显著上调。
(4)miR-16可以通过与Bcl2和FOXO1基因3’UTR互作,在mRNA和蛋白水平上抑制Bcl2的表达,而仅在蛋白水平抑制FOXO1的表达。类似于miR-16过表达对肌肉细胞生长的调控作用,特异性抑制Bcl2和FOXO1均可以抑制成肌细胞的增殖和促进其凋亡。
(5)在肌肉细胞中抑制FOXO1可以调控1655个基因的差异表达(Fold change>2, FDR<0.05),占整个基因组的13%,其中包括4个显著下调(MyoG、MEF2C、MYL1和MYF5)和2个显著上调(Myo5C和Myo5B)的肌肉生成相关的调控因子。对这些差异基因进行功能富集分析,FOXO1可以调控多个信号通路,包括 ERK5和AMPK信号通路,来促进肌肉分化和肌纤维的形成。
(6)通过整合分析PI3K抑制剂和FOXO1抑制剂对成肌细胞的转录调控变化,发现有114个基因受到PI3K-FOXO1通路的调控作用,包括BCL2A1、CDKN2B和PDK4。
(7)整合分析FOXO1的靶向结合基因组区域和 FOXO1诱导的差异表达基因,发现24个基因被FOXO1的直接靶向转录调控,其中7个基因受到FOXO1的负向调控,17个基因受到FOXO1的正向调控。
(8)FOXO1通过下调MYH7B和上调MYH1B和MYH1D来促进慢肌纤维向快肌纤维转换。PI3K可以通过FOXO1来上调MYH7B的表达,而以不依赖FOXO1的方式上调MYH1D的表达。
综上所述,本研究利用功能基因组学和群体遗传效应分析发现54bp插入突变是导致 miR-16表达水平和调控功能差异的致因性突变。一方面,短片段的插入突变通过引入新的剪切位点而特异性抑制miR-16的表达生成;另一方面,miR-16可以通过靶向抑制Bcl2和FOXO1及FOXO1介导的信号通路来抑制肌肉细胞增殖和分化,促进肌肉细胞的凋亡。