铜是生物必需的微量元素之一。在植物中，铜离子参与光合作用、氧化磷酸化、活性氧清除等许多重要的生物学过程。因此，维持铜离子平衡对于植物的正常生长发育至关重要。铜离子转运蛋白在调控铜离子平衡过程中起着关键作用。迄今，已报道的铜离子转运蛋白分为Ctr类铜离子转运蛋白和P型ATP酶(P-typeATPases)类铜离子转运蛋白两个家族。本研究从小麦中克隆了一个属于MFS超家族(major facilitator superfamily)的新型铜转运蛋白基因TαCT1，对其序列结构特征、表达模式、染色体及亚细胞定位、铜离子转运功能及关键功能位点，以及系统演化等进行了研究。　　 存利用cDNA-AFLP技术对普通小麦品种小假54进行抗逆性相关基因的筛选过程中，获得了一个受PEG6000胁迫诱导上调表达的基因片段。随后通过RT-PCR和RACE等方法，克隆了该基因片段对应的全长cDNA序列和基因组DNA序列。根据3’UTR序列差异，该基因可分为3个成员。利用中国春缺体-四体系，分别将3个基因成员定位到了5A、5B和5D染色体上，且后续实验证明它们具有铜离子转运功能，因此将这3个基因分别命名为TαCT1-5A，TαCT1-5B和TαCT1-5D。序列分析显示，3个TαCT1基因均具有完整的ORF，长度完全相同，为1440bp，编码479氨基酸残基。进一步序列比对表明，TαCT1-5A和TαCT1-5D的ORF序列完全相同，而TαCT1-5B的ORF与前两者有12碱基的差异，在蛋白水平上有4个氨基酸残基的差异。在3’UTR区，TαCT1-5A和TαCT1-5B相对于TαCT1-5D分别有19和15个碱基的缺失。TαCT1-5A，-5B和-5D编码区的基因组序列长度分别为2898、2915和2898bp，均有5个外显子和4个内含子。蛋白高级结构预测表明，TaCT1蛋白具有12个跨膜结构域，在第六和第七跨膜域之间有一个大的胞内环，在第二与第二三跨膜域之间具有保守的DRXXRR基序。这些都是MFS超家族蛋白的典型特征。由此说明TaCT1蛋白属于MFS超家族。　　 表达谱分析表明，TαCT1基因存叶片中表达量最高，根和茎中次之，幼穗中最低。并且，TαCT1基因的表达呈现出明显的昼夜节律性变化，白天表达量较高，夜间表达量较低。金属离子胁迫实验显示，TαCT1基因存叶片中的表达受过量铜和锌离子抑制，而在根中的表达则特异性地受过量铜离子的抑制，暗示TaCT1蛋白可能参与了铜离子的吸收或转运过程。　　 利用转化实验分析了TαCT1基因在酵母细胞中的功能。结果表达TαCT1-5A基因的酵母在过量铜、锌或锰离子的培养基上生长受到明显抑制。金属离子含量检测表明，表达TαCT1-5A的酵母细胞中的铜离子含量显著升高，但锰和锌离子的含量没有显著变化。由此说明，TαCT1-5A基因能够特异性地促进酵母细胞对铜离子的吸收。　　 进一步利用大麦条纹花叶病毒(BSMV)诱导的基因沉默(VIGS)实验验证了TαCT1基因在普通小麦中的铜转运功能。在BSMV-VIGS诱导TACT1基因下调表达后，无论在正常或在过量铜离子胁迫条件下，小麦植株中铜离子的相对含量均显著降低。同时，在过量铜离子胁迫条件下，小麦植株的鲜重显著高于对照植株，生长状态也明显好于对照。即在过量铜离子胁迫条件下，下调TαCT1基因的表达能够显著降低小麦植株中的铜离子含量和减缓铜离子毒害表型。由此证明，TαCT1基因参与了小麦对铜离子的吸收或转运过程。迄今，这是在MFS家族中首次发现具有铜离子转运功能的蛋白。　　 蛋白序列分析表明，在TaCT1-5A蛋白的第一和第九跨膜区分别存在铜离子结合基序(copper binding motif)，在第一跨膜区为属于MXXM基序的M35EVM38，在第九跨膜区为类似于MXCX4C基序的M363WC365LLFTC371C370。由此推测上述两个基序是TaCT1-5A蛋白的关键功能结构域。进一步通过定点突变实验在酵母中对TaCT1-5A蛋白的关键功能氨基酸位点进行了解析。一系列单位点和多位点突变体的功能分析结果表明，只有Met35、Met38和Cys365三位点同时突变可完全抑制TaCT1-5A铜离子吸收或转运功能。由此证明M35EVM38和M363WC365LLFTC371C370是TaCT1-5A蛋白行使铜离子转运功能的重要基序，而Met35、Met38和Cys365是这两个基序中的3个关键氨基酸位点。　　 利用拟南芥原生质体瞬时表达系统对TaCT1-5A蛋白进行了亚细胞定位。结果显示，TaCT1-5A-GFP融合蛋白与高尔基体标签蛋白Man49共定位，由此证明TaCT1-5A蛋白定位于高尔基体。　　 通过NCBI数据库搜索，共搜索到24个与TαCT1有50％以上序列一致性的同源基因。迄今，这些同源基因的功能均未见报道。系统进化分析表明，TαCT1及其同源基因分为3个类群，第一类群(groupⅠ)和第二类群(groupⅡ)的基因都来自单子叶植物，而属于第三类群(groupⅢ)的基因则全部来自双子叶植物。有趣的是，第二类群与同属于单子叶植物的第一类群亲缘关系较远，而与属于双子叶植物的第三类群的亲缘关系反而较近。进一步利用各类群有代表性的基因进行了铜离子转运功能分析。结果表明，只有与TαCT1同属于第一类群的基因具有铜离子转运功能，而第二和第三类群的基因均没有铜离子转运功能。由此推断，TαCT1及同属于第一类群的同源基因应该是在单、双子叶植物分化之后进化出来的一类新基因，其铜离子转运功能可能是单子叶植物特有的一种铜离子调控机制。