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猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)是引起猪圆环病毒相关疾病(porcine circovirus associated disease, PCVAD)的主要病原,是重要的免疫抑制性疾病,给世界养猪业带来了严重的经济损失。猪圆环病毒2型单独感染并不能引起典型的临床症状,当与其它病原体混合感染时能促进疾病的发生。猪圆环病毒2型与猪细小病毒有共同的靶细胞,其混合感染的发病机制仍不清楚,鉴于猪圆环病毒2型与猪细小病毒混合感染是模拟断奶仔猪多系统衰竭综合症(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS)的典型发病模型。本研究拟通过检测猪圆环病毒2型与猪细小病毒体外混合感染不同细胞细胞因子水平变化,对其混合感染的机制进行初步探讨。1. PCV2, PPV, IFN-γ,TNF-α, IL-10, β-actin real-time PCR检测方法的建立本研究根据GenBank中PCV2, PPV,猪IFN-y,猪TNF-a,猪IL-10, β-actin基因序列设计引物,用RT-PCR扩增猪肺泡巨噬细胞中相应的目的基因片段,连接到pMD18-T载体中,经测序验证基因序列的正确性。再根据GenBank中相应序列设计PCV2, PPV,猪IFN-γ,猪猪TNF-α,猪IL-10,猪β-actin real-time PCR扩增引物,以上述构建的重组质粒为模板,优化real-time PCR反应体系及引物浓度,建立检测PCV2, PPV,猪IFN-γ,猪TNF-a,猪IL-10,猪P-actin基因的定量方法,并进行了方法学评价。结果显示,以优化条件后real-time PCR反应所建立的标准曲线各参数均符合要求,标准曲线的判定系数R2均大于0.98,模板浓度在103-108copies/μL具有良好的扩增反应,重复性、稳定性和特异性良好。2.PCV2与PPV混合感染对原代PAM的影响本研究通过PCV2和PPV混合感染PAM后,检测感染后不同时间PCV2和PPV病毒核酸拷贝数及IFN-γ, TNF-a, IL-10 mRNA表达的动态变化,分析PCV2和PPV混合感染对细胞免疫反应的影响。将PAM分为4组：PPV单独感染组、PCV2单独感染组、PCV2与PPV混合感染组、对照组。在接种病毒12h、 24h、36h、48h、60h、72h各时间点提取病毒DNA及PAM细胞总RNA。用已经建立的real-time PCR法检测各组中病毒核酸拷贝数及IFN-γ, TNF-a, IL-10 mRNA表达的动态变化。结果显示,PCV2和PPV混合感染后,PCV2与PPV混合感染组PCV2病毒核酸拷贝数高于PCV2单独感染组,PCV2与PPV混合感染组PPV病毒核酸拷贝数在60hpi后显著高于PPV单独感染组；PCV2单独感染组和PPV单独感染组IFN-γ mRNA表达水平上调,PCV2与PPV单独感染组IFN-γ mRNA表达表达水平下调；病毒感染后都可引起TNF-a mRNA表达水平的上调,36 hpi前PCV2感染起主要作用,48hpi后PPV感染起主要作用,PCV2与PPV混合感染TNF-a mRNA明显高于单独感染组；在24hpi, 36hpi, PCV2和PPV单独感染可引起IL-10 mRNA表达水平的上调,PCV2与PPV混合感染后在36 hpi、48 hpi IL-10 mRNA表达水平显著上调,其它时间不显著。3.PCV2与PPV混合感染对3D4/21细胞的影响本研究通过PCV2和PPV混合感染3D4/21细胞后,检测感染后不同时间PCV2和PPV病毒核酸拷贝数及IFN-γ,TNF-a, IL-10 mRNA表达的动态变化,分析PCV2和PPV混合感染对细胞免疫反应的影响。将3D4/21细胞分为4组：PPV单独感染组、PCV2单独感染组、PCV2与PPV混合感染组、对照组。在接种病毒12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h各时间点提取病毒DNA及3D4/21细胞总RNA。用已经建立的real-time PCR法检测各组中病毒核酸拷贝数及IFN-γ,TNF-a, IL-10 mRNA表达的动态变化。结果显示,PCV2和PPV混合感染后,PCV2与PPV单独感染组PCV2病毒核酸拷贝数和PPV病毒核酸拷贝数分别于36 hpi和24 hpi高于单独感染组；PPV单独感染组IFN-γ mRNA表达水平高于PCV2单独感染组IFN-γ mRNA表达水平,PCV2与PPV单独感染组IFN-γ mRNA表达水平在12 hpi时高于PCV2单独感染组,24 hpi后低于对照组及单独感染组；PPV单独感染组TNF-α mRNA表达水平在24 hpi后上调,PCV2单独感染组TNF-α mRNA表达水平在24 hpi后上调,在48 hpi后高于PPV单独感染组,PCV2与PPV单独感染组TNF-α mRNA表达水平在36hpi后上调,并明显高于单独感染组；PCV2单独感染组IL-10 mRNA表达水平在24 hpi及48 hpi后轻微上调,PPV单独感染组对IL-10 mRNA表达水平没有影响,PCV2与PPV单独感染组IL-10mRNA表达水平在24 hpi后显著上调,48 hpi达到高峰。综上所述,PCV2与PPV混合感染后促进了2种病毒的复制并抑制了IFN-γ mRNA的表达,促进了TNF-α和IL-10 mRNA的表达,因此可能使细胞免疫功能紊乱,从而促进了疾病的发生。