土壤中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B908的分子检测

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枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B908是由中国农业大学提供的从江西水稻根际土壤中分离到的一株具有生防作用的野生菌株,该菌株对水稻纹枯病菌有较的强拮抗作用.经实验证明,对烟草、三七、花卉、小麦、白菜等作物的土壤病害也具有很好的防治效果.现已经由云南农大植物病理实验室、中国农大植保学院生防室和云南省星耀生物制品厂,共同进一步开发研究,主要有效成分为"枯草芽孢杆菌B908"的微生物农药产品"百抗".为了解B908在土壤中定殖和消长动态的情况,该研究利用土壤回收DNA/PCR技术来检测土壤中的微生物,初步建立起一套检测土壤中B908的分子检测体系.具体工作如下:1、使用RAPD、扩增脂肽抗生素相关基因和AP-PCR 3种方法分析枯草芽孢杆菌与其他常见微生物之间的遗传多样性,从中寻找特异条带.在所有尝试中,只有从RAPD方法所获得的多态性条带中找到了一个特异条带.回收此条带,克隆测序.将测序结果在NCBI中用BLAST和FASTA工具进行搜索,与现已知的基因序列比较,没有发现与此序列相似或同源性较高的其它序列.根据序列进行SCAR引物的设计,得到引物T1.用T1引物进行PCR反应,在所有供试菌中,只有B908能扩增出目的条带,其余菌株无相同条带或没有扩增产物.2、从土壤中提取微生物DNA的总量是分子检测成功的关键之一,该文结合国内普通实验的实际情况,分别选用两种经济、简单的裂解细胞方法(溶菌酶/SDS/冻融组合法,煮沸法)和DNA纯化方法(氯仿/异戊醇,玻璃奶)提取土壤微生物的DNA总量,并进行比较分析和PCR扩增检测.结果表明,只有溶菌酶/SDS/冻融法获得DNA后用玻璃奶纯化法所获得的DNA才能满足PCR反应的要求.用此方法提取不同类型土壤微生物的总DNA,并进行比较,发现从沙土获得的DNA量最大,温室土和菜园土之间相差不明显,且从不同类型土壤中获得的微生物DNA都能满足PCR反应的要求.3、利用特异引物对接种有B908的土壤DNA进行PCR扩增,结果表明,只有在接有B908菌的土壤中,可以扩增到目标菌的DNA,其检测下限为10<6>cfu/g土.对接种B908的土壤进行20天的监测研究.初步建立起一套检测土壤中B908的分子检测体系.
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