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目的1.研究不同地区旱獭对WHV的易感性,了解不同毒株、不同剂量的WHV接种旱獭后的自然经过,完善WHV感染的旱獭模型,。2.建立旱獭T淋巴细胞免疫应答的检测方法。3.研究恩替卡韦联合DNA疫苗pWHcIm对WHV感染的早期干预作用。方法1.捕获来自不同地区的旱獭,静脉接种含有WHV病毒的血清,观察其对WHV的易感性;用不同的WHV毒株接种易感地区的旱獭,观察不同毒株的影响;分别用高,中,低剂量的WHV59毒株接种易感地区的旱獭,观察不同剂量的WHV接种后的自然经过。2.分离旱獭PBMC,建立旱獭T细胞应答的检测方法,包括CFSE染色检测旱獭PBMC增殖,CD107a检测旱獭特异性CTL应答,PD1,PDL1,FOXP3染色及其免疫应答相关分子mRNA表达的real-time RT-PCR的方法。3.野外捕获的成年旱獭24只,体重在2-3kg。经足背静脉接种含有WHV59病毒的血清,病毒接种后24小时,18只旱獭分别经过如下三种处理:口服抗病毒药物恩替卡韦,0.5mg/kg/day,持续服用8周;在接种病毒后的第1,4,7周用表达WHV核心抗原的质粒免疫;口服恩替卡韦联合质粒免疫。余下6只旱獭作为空白对照。20周后,旱獭接种WHV0908毒株。选择2只健康旱獭作为此次病毒接种的对照。应用ELISA、real-time-PCR检测旱獭血清WHV感染标志物的动态变化:WHsAg、WHsAb、WHcAb和WHV DNA。real-time-RT-PCR检测旱獭PBMC中免疫应答相关分子的表达。结果1.来自1,3地区的喜马拉雅旱獭对WHV易感,病毒呈现高复制;WHV59毒株使喜马拉雅旱獭出现急性感染,而WHV59的传代毒株(stock0908和stock0925)使旱獭同样出现急性感染;中剂量WHV59接种后旱獭出现病毒血症的时间延迟,而低剂量WHV接种旱獭后不能出现病毒血症。2.新鲜分离的旱獭PBMC进行CFSE染色,5μg/ml的ConA刺激旱獭淋巴细胞5天,CFSEdim CD4+细胞百分比高达92.15%。新鲜分离急性WHV感染旱獭的PBMC,2μg/ml WHc96-110的肽段特异性刺激3天后,CD3+CD4-CD107a的表达为3.98%,相比2μg/ml CMV无关多肽刺激(0.85%)和空白对照(0.67%)有明显的增高。在病毒血症高峰期,CD4-细胞的PD-1表达达到高峰,阳性细胞百分比达到13.77%,CD4+细胞的FOXP3的表达为4.44%,PD-L1在病毒血症晚期CD4+和CD4-T细胞均有短暂上调,其百分比分别为2.17%和6.05%,病毒清除后降至正常水平。3.24只成年旱獭初次WHV感染后,所有仅用DNA疫苗免疫的旱獭均出现病毒血症和核心抗体,与未处理的对照旱獭相似。除仅用恩替卡韦处理的2只旱獭未出现WHcAb外,恩替卡韦联合质粒免疫及仅用恩替卡韦处理的所有旱獭均出现WHcAb而未出现病毒血症。再次病毒接种后,所有的质粒免疫旱獭,恩替卡韦联合质粒免疫的旱獭以及未处理的对照动物及其部分仅用恩替卡韦处理的旱獭(4/6)均不出现病毒血症。结论1.旱獭的遗传背景及病毒的接种剂量影响WHV感染的结局,传代病毒接种产生与原代病毒感染类此的感染结局。2.建立了旱獭T细胞应答的检测方法,为旱獭WHV感染模型应用于HBV感染的免疫发病机制研究及评估免疫治疗策略提供研究手段。3.早期应用抗病毒药物和/或抗病毒药物联合DNA疫苗,可以抵御WHV的初次感染,且部分或全部旱獭产生了有效的保护性免疫应答,可以抵御WHV的再次感染。本研究的创新点及意义1.旱獭广泛分布在我国西北特别是青藏高原,与土拨鼠种系(线粒体DNA序列分析)发生十分接近,近年已经报道中国旱獭对WHV有易感性,因此WHV感染旱獭模型非常适合于研究嗜肝病毒的急慢性感染。2.首次在旱獭WHV感染模型体内建立T淋巴细胞应答的检测方法,包括CFSE染色检测淋巴细胞增殖,CD107a及流式细胞术分析特异性CTL应答,real-timeRT-PCR检测细胞因子表达,为旱獭模型的进一步推广应用提供研究手段。3.首次利用WHV感染旱獭模型研究早期应用抗病毒药物和/或抗病毒药物联合DNA疫苗对WHV感染过程的影响,为探讨HBV感染后的早期免疫应答及保护性免疫应答的产生提供重要的实验依据,并为HBV意外或针刺暴露者提供新的干预方案。