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牛和羊是重要的节粮型畜种,可为人类提供肉、奶、皮、毛等优质的畜产品。然而,牛是单胎动物,羊是少(寡)胎动物,自然繁殖力低是制约这两种动物生产经济效益的主要原因。因此,研究牛羊繁殖基础理论,开发提高牛羊繁殖力的育种和繁殖新技术具有重要意义。培育繁殖力高的新品种是提高牛羊繁殖力的重要手段,分析牛羊繁殖性状分子遗传规律和调节机制,开发分子标记辅助选择技术,是培育新品种的基础。牛羊繁殖性状是重要的经济性状,也是复杂的数量性状,受微效多基因控制,同时也受一个或几个主基因控制,筛选鉴定繁殖性状主基因并阐明其作用机制,研究其对卵泡发育的调控作用,对于开发提高牛羊繁殖力的新技术(如胚胎工程、繁殖控制等),建立分子育种技术(如标记辅助选择、转基因育种等),快速改良和提高牛羊繁殖性能具有重要的理论和实际意义。本研究从检测主要生殖激素、次要生殖激素和细胞因子基因多态性着手,分析多态性与产羔数、卵泡发育、精液品质之间的关系,鉴定牛和羊主要繁殖性状主基因,并利用RNA干扰技术鉴定主基因功能,探讨其作用机制,为建立高繁殖力牛羊繁殖和育种新技术奠定理论基础,提供技术支撑。1.山羊产羔和牛精液品质与卵泡发育性状主基因鉴定利用候选基因法,采用PCR-SSCP、PCR-RFLP和Forced PCR-RFLP等技术,分析了FecB、FecX(包括FecXI、FecXH、FecXB和FecXG)、与FecB和FecX连锁的5个微卫星标记(BMS2508、OARHH35、BM143、BM1329和TGLA68)、GH和INHA在6个山羊品种/群体(波尔山羊、海门山羊、黄淮山羊、马头山羊、努比山羊和波淮杂交一代羊)共计614个样本中的多态性,及候选基因或微卫星多态性对山羊产羔和生长性状的影响,鉴定山羊产羔性状主基因,筛选相关分子标记;同时采用PCR-RFLP技术研究了INHβA在荷斯坦种公牛中的多态性,及其对精液品质性状的影响,筛选分子标记,并鉴定荷斯坦种公牛精液品质性状主基因,发现:(1)绵羊繁殖性状主基因FecB(BMPR-IB突变体)、FecX(包括FecXI、FecXH、FecXB和FecXG,均为BMP15突变体)在波尔山羊、海门山羊、黄淮山羊、马头山羊、努比山羊和波淮杂交一代6个品种/群体共计614只羊中不存在多态性,即山羊BMPR-IB的突变体FecB和BMP15的突变体FecX不是山羊产羔性状主基因;(2)与FecB(BMPR-IB突变体)连锁的4个微卫星座位(BMS2508、OARHH35、BM143和BM1329)及与FecX(BMP15突变体)连锁的微卫星座位(TGLA68)在山羊中存在多态性,且不同基因型对波尔山羊产羔数性状影响显著;说明BMPR-IB和BMP15是山羊产羔性状主基因,在这两个基因中可能存在除FecB和FecX外的其他主效位点控制山羊产羔性状;(3)在波尔山羊GH基因中检测到2个SNPs(A781G和A1575G),在A781G位点检测到AA和AB两种基因型,BB基因型缺失,在A1575G位点检测到CC和CD两种基因型,DD基因型缺失;GH基因对波尔山羊的基因效应存在性别差异,对波尔山羊公羊早期生长性状调控作用显著,是波尔山羊公羊生长性状主基因,但对母羊早期生长性状调控作用不明显;波尔山羊母羊GH基因型间产羔数无统计差异(p＞0.05);GH是否对山羊产羔数有直接调控作用,尚需进一步研究;(4)在山羊抑制素α亚基基因(INHA)中共检测到11个遗传多态,分别为-506-＞G、-446C＞T、-155C＞T、-65G＞C、129G＞A、567G＞A、651A＞G、792T＞C、906C＞T、911T＞C、946A＞C,其中,911T＞C和946A＞C分别引起该处氨基酸编码改变,即299Val＞Ala和311Thr＞Pro;-446C＞T、651A＞G和946A＞C位点对不同山羊品种产羔数性状影响显著;INHA基因是山羊产羔性状主基因;(5)在荷斯坦种公牛抑制素βA亚基基因(INHβA)中发现StyⅠ-RFLP多态性,检测到AA、AB和BB三种基因型,其中AB基因型是优势基因型;性状关联分析结果表明,INHβA对荷斯坦种公牛精液品质有显著影响,不同基因型对精液品质效应表现为:AB＞AA＞BB;INHβA是控制荷斯坦种公牛精液品质的主基因。2主基因INHA对牛卵泡发育调控机制研究在候选基因研究基础上,利用RNAi技术进一步研究繁殖性状主基因抑制素α亚基基因(INHA)对牛卵泡细胞生长、凋亡和类固醇激素分泌水平的作用及作用机制,并探讨了INHA对卵泡发育和排卵的局部调节作用,发现:(1)所构建的四种重组干扰质粒(psiRNA1、psiRNA2、psiRNA3和psiRNA4)均能有效降低INHA表达量,其中psiRNA3重组质粒干扰效果最显著;(2)利用RNAi技术干扰INHA,牛颗粒细胞凋亡抑制基因bcl-2和bcl-xl表达量上调,凋亡促进基因Bax表达量下调,细胞因子IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ表达量上调;牛颗粒细胞凋亡减少;细胞周期变化显著,G0/G1期颗粒细胞比例减少,S期和G2/M期颗粒细胞比例增加;雌二醇和孕酮水平上调,雌二醇/孕酮比值下调;这些结果说明,抑制素可能通过调控凋亡家族(bcl-2家族)、细胞生长因子(IGF家族)相关基因表达量和类固醇激素分泌量,发挥其在卵巢内部的局部调节作用,抑制颗粒细胞增殖,促进颗粒细胞凋亡,从而抑制卵泡发育和排卵。