心肌肥厚是由细胞外刺激信号作用于细胞并通过一系列信号转导通路引起细胞内基因表达的活化与失活,并最终引起细胞表型改变的过程。它主要表现为心肌细胞的肥大和间质成分的改变。早期的病理性心肌肥厚为代偿性反应,可以平衡室壁压力,维持心输出量,消除初始刺激的影响。但长期心肌肥厚会导致心功能失代偿,心肌细胞凋亡,直至心肌扩张,最终发生心力衰竭。从细胞和分子水平上看,心肌细胞肥大的分子机制主要包括以下3个环节:细胞外的刺激信号,细胞内的信号转导和细胞核内的基因转录的活化。脂肪组织是机体最大的内分泌和旁分泌器官,能够分泌多种细胞因子和生物活性物质。不仅调控体内能量平衡,而且在调节胰岛素敏感性、糖尿病、凝血、纤溶、炎症、动脉粥样硬化等的发生和发展中发挥的重要作用。其中发挥促炎作用的有肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL-6)、纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)、瘦素(leptin)、抵抗素(resistin)、趋化素(chemerin)、内脂素(visfatin)、视黄醇结合蛋白(retinol binding prorein,RBP)等,而网膜素(resistin)、脂连素(adiponectin)、Clq/肿瘤坏死因子相关蛋白9(CTRP9)等主要发挥抗炎作用。分泌型卷曲相关蛋白5(s FRP5)是一种新近发现的与肥胖和胰岛素抵抗有关的脂肪细胞因子和抗炎因子,属于分泌型卷曲相关蛋白(secreted Frizzled-related protein,s FRP)家族中的一员,主要由白色脂肪组织分泌,它除了可以在脂肪组织中表达外,在视网膜色素上皮细胞中高表达,在胰腺中也有表达,在肝脏和肌肉组织中也有微弱表达。已经有研究证实,分泌型卷曲相关蛋白1-4在心肌组织中表达,分泌型卷曲相关蛋白3、4在心肌肥厚中表达增加。在结构上,分泌型卷曲相关蛋白通过具有同源结构的半胱氨酸富含区(Cysyerne rich region,CRD)与Wnt信号通路的特异性受体卷曲蛋白受体(frizzled receptor,Fz)竞争结合,从而抑制Wnt信号通路的传导。Wnt蛋白是一组富含半胱氨酸的糖基化蛋白,参与细胞的增殖、分化、控制细胞的定位以及凋亡等过程。目前已经证实Wnt通路与心肌肥厚有一定关联,抑制Wnt通路在逆转心肌肥厚过程中发挥有效作用。Wnt信号通路参与调控细胞增殖、分化、凋亡及机体免疫等多种病理生理过程。研究表明,Wnt信号通路在心脏发育和血管生成中起重要作用,心脏发育早期激活Wnt/β-catenin信号通路,促进心脏祖细胞增殖和迁移,在心脏发育晚期抑制其活性可以促进心肌细胞分化,近年在心血管疾病的发生以及发展中的作用被广泛关注。研究证实,分泌型卷曲相关蛋白5作为抗炎症因子可能在动脉粥样硬化中具有保护作用。血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)能促进心肌细胞肥大,心肌成纤维细胞增殖,在心肌肥厚过程中起着重要作用。Ang II的生物学作用主要是通过Ang II 1型受体(Ang II types 1 receptor,AT1R)和Ang II 2型受体(Ang II types 2 receptor,AT2R)介导的。这两种受体均属于G蛋白偶联受体,但是它们的组织分布以及细胞内信号转导途径是不相同的。Ang II与AT1R结合可引起心肌肥厚和细胞外基质蛋白的积聚、促进醛固酮分泌等,而Ang II与AT2R结合则起与AT1R结合相反的作用,可使血管扩张、抗平滑肌细胞增殖和参与组织修复等起到保护作用。已有研究证实在心室肥厚、心肌梗死以及心力衰竭时AT2R表达相对上调,介导Ang II的主要作用。AT1R主要分布于肺、血管平滑肌、肝、肾、肾上腺等器官,而AT2R则主要分布于胚胎组织、脑和生殖器官等。由此我们猜测s FRP5在心肌肥厚中的表达是否与这两种受体有关,究竟是由哪种受体介导的,是本研究的主要内容之一。Rho/ROCK(Rho-associated coiled-coil protein kinase)信号通路位于多种信号通路的上游,有“分子开关”的作用,它将胞质信号转入核内,从而调控相关的基因和蛋白表达。是多种组织细胞中普遍存在的一条信号转导通路。大量研究表明Rho/ROCK信号通路广泛参与心血管系统的各种病理生理进程,例如心肌细胞收缩、迁移、增殖、凋亡,心肌肥厚,心肌梗死后心室重塑等。Rho激酶可能参与调控Ang II诱导的心肌肥厚和血管平滑肌肥大等过程,Rho/ROCK通路参与了AT1 R的信号传导。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protine kinase,MAPK)信号通路是细胞内信号转导的主要途径之一,是细胞膜信号向核信号传递的枢纽。该通路是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,目前发现有四种亚型:细胞外调节蛋白激酶1、2(extracellular signal–regulated kinase 1/2,ERK1/2),P38MAPK,c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal Kinase,JNK)和ERK5,它们在调控细胞功能时相互交错,在调控细胞生长、分化和凋亡等一系列不同的生理过程中发挥重要作用。现在已有研究证实MAPK的激活是心肌细胞肥大和由收缩型向肥厚型转换的最后通路,与心肌重构及心衰的发生密切相关。JNK信号通路是MAPKs家族的重要通路之一,参与调控细胞的增殖、分化与凋亡,是多种胞浆信号向核内传递的枢钮。已有研究证实,激活的Rho/ROCK信号通路可以通过JNK通路介导的心肌纤维化过程。综上所述,我们推测s FRP5可以在心肌细胞中表达,并且在心肌肥大过程中呈现上调趋势。本研究以培养的新生SD大鼠心肌细胞为研究靶细胞,采用Western Blot和Real-time PCR技术观察Ang II诱导心肌细胞s FRP5表达的变化情况;并探讨Ang II-AT1R?Rho?ROCK?JNK信号转导系统在Ang II诱导大鼠心肌细胞s FRP5表达过程中的可能作用。本研究主要包括以下三部分:第一部分分泌型卷曲相关蛋白5在心肌细胞中的表达目的:成功提取并培养SD乳鼠心肌细胞,观察心肌细胞是否表达分泌型卷曲相关蛋白5,为以后的进一步研究奠定基础。方法:购买出生2-3天的SD乳鼠,提取并培养原代心肌细胞,培养48h后换为无血清的培养基继续培养24h,之后应用RT-PCR、Western-Blot、免疫细胞化学技术观察心肌细胞中分泌型卷曲相关蛋白5表达情况。结果:Real-Time PCR结果示:SD乳鼠心肌细胞中有分泌型卷曲相关蛋白5在m RNA的表达。Western-Blot结果示:SD乳鼠心肌细胞有分泌型卷曲相关蛋白5蛋白的表达。结论:分泌型卷曲相关蛋白5能够在心肌细胞中表达。第二部分血管紧张素II对心肌细胞肥大中分泌型卷曲相关蛋白5表目的:建立心肌细胞肥大模型,观察在心肌细胞肥大过程中分泌型卷曲相关蛋白5的表达情况。方法:购买出生2-3天的SD乳鼠,提取并培养原代心肌细胞,培养48h后换为无血清的培养基继续培养24h,之后应用Ang II在不同浓度、不同时间干预心肌细胞。应用RT-PCR、Western-Blot技术检测心肌细胞中分泌型卷曲相关蛋白5的表达情况,应用Western-Blot技术检测心肌细胞BNP表达情况。结果:在Ang II的干预下,心肌细胞分泌型卷曲相关蛋白5和BNP的表达随着Ang II干预浓度和干预时间的延长而增加。在m RNA和蛋白水平,分泌型卷曲相关蛋白5在Ang II 10-6 mo1/L干预48h后达到最高值(P<0.05)。BNP蛋白水平随Ang II浓度的升高和干预时间的延长而增加,在Ang II 10-6 mo1/L干预48h后达到最高值(P<0.05)。结论:在Ang II诱导的心肌细胞肥大过程中,s FRP5表达明显增加。第三部分血管紧张素II主要通过血管紧张素II 1型受体上调分泌型卷曲相关蛋白5的表达目的:建立心肌细胞肥大模型,观察血管紧张素II受体在心肌细胞肥大中分泌型卷曲相关蛋白5表达的作用方法:购买出生2~3天的SD乳鼠,提取并培养原代心肌细胞,培养48h后换为无血清的培养基继续培养24h,之后应用Ang II的不同受体阻断剂干预心肌细胞。应用RT-PCR、Western-Blot技术检测心肌细胞中分泌型卷曲相关蛋白5的表达情况,应用Western-Blot技术检测心肌细胞BNP表达情况。结果:与正常对照组相比,替米沙坦(10μmol/L)+Ang II(10-6 mo1/L)组中,分泌型卷曲相关蛋白5 m RNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.05),但是,较Ang II(10-6 mo1/L)组相比,替米沙坦(10μmol/L)+Ang II(10-6mo1/L)组分泌型卷曲相关蛋白5 m RNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05);而替米沙坦(10μmol/L)组分泌型卷曲相关蛋白5 m RNA和蛋白表达水平较对照组无明显变化(P>0.05)。而PD123319(10μmol/L)+Ang II(10-6 mo1/L)组较Ang II(10-6 mo1/L)相比,分泌型卷曲相关蛋白5m RNA和蛋白表达水平无明显变化(P>0.05)。结论:在Ang II诱导的心肌细胞肥大中分泌型卷曲相关蛋白5表达上调的过程中,Ang II AT1R发挥主要作用。第四部分血管紧张素II上调心肌细胞分泌型卷曲相关蛋白5表达的分目的:观察Rho/ROCK、MAPK信号通路在分泌型卷曲相关蛋白5表达中发挥的作用以及它们的关系。方法:购买出生2-3天的SD乳鼠,提取并培养原代心肌细胞,培养48h后换为无血清的培养基继续培养48h,用Ang II(10-6 mmol/L,48h)干预心肌细胞,诱导心肌细胞肥大,Y27632用来阻断Rho/ROCK通路,同时进行分组:对照组、Ang II组、Ang II+Y27632组,Y27632组,观察分泌型卷曲相关蛋白5的表达。同时,用AT1R阻断剂替米沙坦作用于心肌细胞,分为对照组、Ang II组、Ang II+替米沙坦组、替米沙坦组,观察心肌细胞p-MYPT1,总MYPT1的表达情况。之后分别应用SB203580、PD98059及SP600125阻断p38 MAPK、ERK1/2、JNK通路,观察分泌型卷曲相关蛋白5的表达情况;同时应用ROCK抑制剂Y27632作用于心肌细胞,分为对照组、Ang II组、Ang II+Y27632组、Y27632组,观察p-JNK,总JNK的表达情况。应用real time-PCR、Western-Blot技术检测心肌细胞分泌型卷曲相关蛋白5的表达,Western-Blot技术检测p-MYPT1,总MYPT1,p-JNK,总JNK的表达情况。结果:用Y27632干预心肌细胞后,心肌细胞分泌型卷曲相关蛋白5的m RNA及蛋白表达水平较Ang II干预组相比均明显降低,(P<0.05)。应用Ang II干预心肌细胞后,总MYPT1及总JNK表达水平无明显变化,但是,p-MYPT1,p-JNK水平明显增加,p-MYPT1/总MYPT1,p-JNK/总JNK表达水平增加。应用AT1R阻断剂替米沙坦干预48小时后,p-MYPT1?总MYPT1水平明显降低,(P<0.05)。用Y27632干预心肌细胞后,p-JNK/总JNK表达水平明显降低(P<0.05)。结论:Rho/ROCK通路在Ang II诱导的心肌细胞肥大中分泌型卷曲相关蛋白5表达增加的过程中是必要的信号通路,Rho/ROCK是AT1-R的下游信号通路。Rho/ROCK信号传导通路与其下游的MAPK通路有交互作用,JNK是Rho/ROCK的下游通路。