论文部分内容阅读
蜘蛛拖丝由于具有独特的抗拉性和弹性的力学特性而备受关注。随着对蜘蛛丝的化学组成、分子结构及基因序列等了解的加深,诸多学者探讨了采用基因工程技术,通过山羊乳腺、细菌、烟草或马铃薯和家蚕等获得蜘蛛丝蛋白的方法,但均未能获得理想的效果。本研究以小鼠为实验动物模型,利用蜘蛛拖丝蛋白基因2S、pIRES2-EGF载体和PMX载体构建逆转录病毒载体PMX-2S-IRES-EGFP,并经platE细胞包装获得2S假病毒,探讨了通过假病毒感染小鼠ES细胞,再通过囊胚注射制备整合有目的基因嵌合体小鼠的方法,为最终建立通过转基因动物获取蜘蛛拖丝蛋白的方法奠定基础。本研究的结果如下：1. PMX-2S-IRES-EGFP逆转录病毒载体的构建将蜘蛛拖丝蛋白基因2S与载体pIRES2-EGFP连接,酶切获得2S-IRES-EGFP片段后与逆转录病毒载体PMX相连,构建既表达蜘蛛拖丝蛋白基因2S又能表达绿色荧光蛋白基因GFP的逆转录病毒载体PMX-2S-IRES-EGFP;双酶切和PCR检测及序列分析结果显示,该载体与所设计的理论序列一致。2.2S假病毒的获得及其滴度检测采用脂质体法将逆转录病毒载体PMX-2S-IRES-GFP转染platE和293GP细胞后的第48h,表达GFP的platE细胞数量明显高于293GP细胞；另外,当采用磷酸钙法转染platE细胞时,在转染后的第48h约有90%的细胞表达GFP。用上述方法获得的2S假病毒感染NIH-3T3细胞,不仅能够检测到GFP的表达,而且检测到目的基因2S-IRES-EGFP在阳性NIH-3T3细胞基因组中整合。经计算2S假病毒滴度达到2×105cfu·mL-1。3.小鼠ES细胞的传代培养通过不同发育时期的胎鼠皮肤成纤维细胞、丝裂霉素C处理时间及细胞培养密度的筛选,获得了最佳的饲养层细胞,并建立了ES细胞的培养体系；利用该体系对馈赠获得的小鼠ES细胞进行培养后,其细胞形态、细胞增殖特性正常；将传代培养的ES细胞经冷冻复苏后,仍保持ES细胞形态和生长特性,且培养后的第72h,细胞克隆达培养皿面积60%以上。4.小鼠ES细胞的检测将上述培养的ES细胞用碱性磷酸酶试剂盒染色后,呈现碱性磷酸酶阳性；将ES细胞用多能性因子检测试剂盒进行免疫组化染色后,在倒置荧光显微镜下可检测到SSEA1、Oct4、Nanog和Sox2的表达。5.ES细胞2S假病毒的感染用2S假病毒感染小鼠ES细胞并扩大培养,续培养的第24h可观察到大量GFP阳性细胞克隆；经PCR鉴定,阳性细胞基因组中可检测出与与理论序列一致的2S-IRES-EGFP目的基因条带(约750bp处)；核型分析结果显示,约有70%的阳性细胞具有正常的2n=40条染色体。6.阳性ES细胞嵌合体小鼠的制作采用小鼠囊胚注射制作嵌合体方法,将阳性ES细胞注入90个来源于雄性C57BL/6和雌性ICR小鼠的囊胚,共获得77个正常的重构囊胚,将其中的70个重构胚移植于5只假孕雌性小鼠的子宫后,2只怀孕并分娩13只,其中存活11只(雄性7只,雌性4只)。在11只幼鼠中有5只尾部出现嵌合(白色斑块)。7.嵌合体小鼠的检测提取11只嵌合体小鼠的尾基因组DNA后,经PCR检测,有6只小鼠的基因组中检测到2S-IRES-GFP目的条带(约750bp),与阳性对照(PMX-质粒)扩增条带一致；在载体PMX-2S-IRES-GFP的GFP基因片段上设计探针引物并制备探针,利用制备的探针对经PCR检测为2S阳性的6只鼠尾基因组DNA进行southern blot检测,其结果,在2只鼠尾基因组中检测到了整合位点；提取经southern blot检测有目的基因整合的一只小鼠内脏和肌肉组织的基因组DNA,并利用探针引物进行PCR检测,其结果,在肌肉、心脏、肝脏、肺、胃、肠、胰腺和睾丸中检测到了的目的条带(约为250bp)。8.嵌合体小鼠F1代的检测将经鼠尾基因组PCR和southern blot检测为阳性的雄性小鼠与嵌合体雌鼠进行交配后,获得10只幼鼠(雄性6只,雌性4只)。分别提取10只幼鼠的尾基因组DNA,并采用PCR法进行检测,其结果,嵌合体小鼠的F1代中,有9只小鼠的基因组DNA中检测到2S-IRES-GFP目的条带(约750bp)。综上所述,本研究利用蜘蛛拖丝蛋白基因2S、pIRES2-EGF和PMX载体构建了PMX-2S-IRES-EGFP逆转录病毒载体,建立了通过小鼠ES细胞囊胚注射获得转蜘蛛拖丝蛋白基因2S嵌合体小鼠的方法,为进一步通过转基因动物获取蜘蛛拖丝蛋白奠定了坚实基础。