宫颈癌（cervical cancer,CC）在全球范围内的发病率和死亡率均逐年增加,给女性的健康带来严重的威胁。目前研究表明:机体细胞在受到“基因突变”或“环境”（比如病毒感染、慢性炎症、射线的辐射、环境污染等）的调控并经过“上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）”或者经癌症干细胞（cancer stem cells,CSCs）促进肿瘤的恶性进展。传统医学对于宫颈癌的辨治,多将其归属于“阴疮”、“无色带”、“恶疮”、“崩漏”等范围。治疗上多采用标本兼治。本虚为主者,“扶虚补正”,标实为主者,“化瘀清络”、“化痰软坚”、“去湿化毒”。现代医学对宫颈癌的诊断较为明确,但其发病机制尚不十分明确,治疗上以手术、化疗、放疗、免疫治疗等手段为主,然而其远期疗效不甚满意,同时放、化疗等又具有较多的副作用。所以急需开发新的有效的治疗宫颈癌的药物。民族药是祖国医药宝库中的瑰宝,也是新药发现的重要源泉。我国民族药种类较多,同时各民族药在防治重大疑难疾病方面积累了丰富的经验,其中壮医药在防治类风湿性关节炎等免疫系统疾病和抗肿瘤方面有丰富的临床积淀。近年来,庞宇舟教授等壮医药科技工作者依托广西高校壮医方药基础与应用等重点实验室,大力开展特色壮药研究,取得了一系列研究成果。飞龙掌血（壮名:温肖Oencu）是一种珍贵的壮药,药材为飞龙掌血的根,是壮医临床常用药,飞龙掌血是芸香科植物,其根（asiatic toddalia root,ATR）具有祛风毒、通龙路、散瘀止血等功效,壮医将该药于广泛使用于风湿类疾病、骨伤类疾病和妇科疾病的治疗,取得较好临床疗效。药理研究结果显示,ATR具有升压、舒张血管、调节肿瘤细胞生长等作用,同时,已有证据证实飞龙掌血具有抑制A型流感病毒活性的功效。然而,目前尚未有飞龙掌血对宫颈癌细胞的抗肿瘤作用的报道。医学研究报道:宫颈癌细胞培养物上清液中可观察到极高的炎症因子水平,这些细胞因子包括转化生长因子-β（transforming growth factor,TGF-β）、干扰因子 γ（interference factor gamma,INF-γ）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1 beta,IL-1β）等,可以极高地表达EMT和转移相关转录因子。这些因子与宫颈癌的恶性进展密切相关。另外,核因子Kappa B因子（NF-κB）在多种疾病炎症发生发展中扮演关键的核转录调节因子。已明确,其同样在肿瘤微环境和肿瘤细胞中高水平表达。典型NF-κB激活机制涉及p50和p65结合位点的磷酸化暴露、转位到细胞核和调控癌基因转录。NF-κB的激活可增加炎症反应和相关基因如对转移、肿瘤细胞免疫环境和上皮间充质转化EMT的调节。因此,NF-κB信号通路可能是治疗宫颈癌的关键靶点。但是,关于飞龙掌血对NF-κB信号通路的调节作用并不十分清楚。CSCs是细胞的亚群,与胚胎干细胞（ESC）具有一些相似的特征并显示干细胞特性,包括自我更新,肿瘤发生,肿瘤生长和分化。CSCs已在包括宫颈癌在内的许多不同类型的肿瘤中得到鉴定。CSCs可以促进肿瘤发生和耐药性。某些干细胞标志物,例如CD133,OCT4,SOX2,Nanog和CD44,已被普遍地用于分离CSCs亚群。而这些CSCs被认为具有治疗抗性,并在肿瘤细胞自噬调控、癌症的复发和转移中起关键作用。多种抑制CSCs的药物已经被证实具有较好的抗癌作用。然而飞龙掌血是否对宫颈癌的CSCs具有抑制作用有待进一步深入研究。对抗宫颈癌的抗癌药物的探索是当下肿瘤医学领域所关注的焦点,干扰或阻断炎症信号转导、EMT信号转导等药物作为新肿瘤治疗的靶点被人们所重视。已有研究证实,源于飞龙掌血根部的香豆素类和香豆素衍生物类化合物在多种肿瘤化疗中大部分都具有良好的抑癌活性。如橙油素（Auraptene,AUR）对啮齿动物的皮肤癌、舌鳞癌、食道癌和结肠癌细胞和组织都有明显的抑制作用。可以预见AUR是一种极具开发价值、应用前景广阔的潜在抗癌药物。同时,基于临床和药理研究提示,飞龙掌血及其单体成分橙油素（AUR）对宫颈癌细胞的增殖具有抑制作用。本研究探讨并评价其在宫颈癌治疗中的作用及其可能机制,也是一种创新性的探索工作。基于以上研究工作报道,本研究的目的是基于抗风湿性与免疫的直接关联,结合临床和药理学研究报道,挖掘并证明壮药飞龙掌血在妇科肿瘤性疾病---宫颈癌治疗中的作用效果,同时抽取其中的抗肿瘤作用较为明确的成分AUR,从肿瘤细胞的免疫逃逸与细胞干性探讨其抗宫颈癌的可能作用途径和靶点,为飞龙掌血的进一步临床应用奠定实验基础。实验一飞龙掌血单体AUR对宫颈癌细胞的功能调节研究目的:研究飞龙掌血新型单体成分AUR对宫颈癌细胞的生存生长能力、细胞周期进程、凋亡和细胞迁移能力的调节作用。方法:培养3种宫颈癌细胞,应用transwell细胞克隆实验、划痕形成的细胞伤口愈合实验、细胞平板克隆形成实验、FACS细胞流式技术、宫颈癌K-8细胞增殖活性检测法等,对不同浓度AUR（0、25、50、100 μM）分别处理的宫颈癌细胞,观察其对细胞的存活率、细胞周期进程、细胞凋亡、细胞的迁移能力的影响,Western Blot检测细胞中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase 9,MMP-9）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、细胞凋亡调节蛋白cleaved-caspase3、和细胞凋亡标志物Bax/Bcl-2的表达。结果:与0μM比,25 μM、50 μM、100 μM的AUR均增加宫颈癌细胞的凋亡率（P<0.05）,显著性抑制宫颈癌细胞的存活率（P<0.05）,不影响健康宫颈上皮细胞的存活率（P<0.05）,抑制宫颈癌细胞的平板克隆形成能力（P<0.05）、细胞的G1/S期进程（P<0.05）、以及细胞迁移率（P<0.05）。而且AUR对细胞凋亡率的影响呈现剂量依赖性（均为P<0.05）,随着剂量的增加AUR对细胞的影响逐渐增强。与 0 μM 比,25 μM、50 μM、100 μM 的 AUR 明显抑制 PCNA、Cyclin D1、MMP-9、VEGF的相对蛋白表达水平（均为P<0.05）,而且上调cleaved-caspase3和Bax/Bcl-2的相对蛋白表达水平（均为P<0.05）。结论:AUR对宫颈癌细胞的增殖活性、细胞周期、细胞迁移均有抑制作用,并且上调宫颈癌细胞的凋亡。实验二AUR调节宫颈癌细胞的免疫逃逸目的:研究宫颈癌细胞和自然杀伤细胞NK细胞共培养系统中施加AUR对免疫逃逸相关因子和NK细胞的影响,探讨AUR是否可作为促免疫杀伤药物参与抑制宫颈癌的进展。探明AUR刺激下炎症和免疫逃逸相关的细胞因子的表达量变化。方法:将Hela细胞与和自然杀伤（NK）细胞共培养,经过100μM AUR处理24 h（AUR-100）。使用FACS技术检测Hela细胞表面ULBP1、ULBP2、ULBP3的表达水平。使用Western Blot法检测Hela细胞中ULBP2和TLR4的表达。并使用ELISA法检测免疫逃逸相关因子的水平。结果:与对照组比,Hela细胞表面的NKG2D配体ULBP2的相对表达水平明显上调（P<0.05）。尤其是AUR-100抑制了 TLR4和ULBP2的表达（P<0.05）,增加了NK细胞的存活率和细胞培养物上清液中免疫相关因子的水平（P<0.05）。结论:AUR抑制TLR4和NKG2D途径并增加NK细胞对Hela细胞的杀伤活性。实验三AUR调节宫颈癌细胞的“干性”特征目的:研究AUR对宫颈癌细胞CD44V6介导的CSCs“干性”的影响。方法:使用流式细胞术分选Hela细胞和CaSki细胞的CD44V6（+）细胞。采用Western Blot检测Hela细胞和CaSki细胞中CD44V6的表达和CD44V6（+）细胞干性标志物OCT4、OPN、CD133的表达水平。使用AUR-100理CD44V6（+）Hela细胞和CD44V6（+）CaSki细胞24 h。干细胞成球实验检测AUR对以上细胞的成球功能、细胞周期变化,Western Blot检测CD44V6（+）Hela细胞和CD44V6（+）CaSki细胞中干性标志物OCT4、OPN、CD133的表达水平及EMT的标志物Twistl、MMP-9、VEGF表达水平。结果:Hela细胞和CaSki细胞中表达CD44V6,并且均有一定比例的CD44V6（+）细胞。流式细胞术成功分离了 CD44V6（+）Hela细胞和CD44V6（+）CaSki细胞。并且CD44V6（+）细胞的成球能力增加,且细胞中OCT4、OPN、CD133的表达水平增高（P<0.05）,而AUR明显抑制了 CD44V6（+）细胞的成球数量和大小,抑制细胞中OCT4、OPN、CD133的表达水平（P<0.05）,并增加了 CD44V6（+）细胞在G1细胞期滞留的细胞量（P<0.05）。另外,AUR明显抑制了 CD44V6（+）细胞中EMT的标志物Twistl、MMP-9、VEGF的表达水平（P<0.05）。结论:AUR可以抑制CD44V6介导的宫颈癌细胞的自我更新能力和“干性”标志物并抑制EMT的标志物。实验四AUR通过抑制TLR4/NF-KB信号通路干预宫颈癌免疫逃逸因子和宫颈癌细胞的“干性”特征目的:探讨AUR抑制TLR/NF-κB信号通路对宫颈癌细胞免疫逃逸因子和“干性”特征的影响和调控机制。方法 将Hela细胞与和自然杀伤（NK）细胞共培养,经过 100 μM AUR 处理 24 h（AUR-100 组）、AUR-100 和 NF-κB抑制剂共培养24 h（AUR-100+BAY11-7085）、AUR-100和NF-κB激活剂共培养 24 h（AUR-100+Betulinic acid）、AUR-100 和 TLR4 拮抗剂共培养 24 h（AUR-100+Resatorvid）、AUR-100 和 TLR4 激动剂共培养 24 h（AUR-100+LPS）。使用 Western Blot 法检测 TLR4、ULBP2、磷酸化 p65 和 IκBα的表达水平。并使用流式细胞术检测CD3-/CD56+的NK细胞比例的变化,检测免疫逃逸相关因子的水平。使用Western Blot检测Hela细胞中CD44V6的表达变化以及细胞干性标志物OCT4、OPN、CD133的表达水平。结果:与对照组比,AUR-100抑制p-p65、TLR4、ULBP2的表达水平（P<0.05）,增加了 IκBα 的相对表达水平（P<0.05）。与 AUR-100 比,AUR-100+BAY11-7085进一步抑制p-p65和ULBP2并促进IκBα的表达（P<0.05）,但对TLR4的表达无影响。与 AUR-100 比,AUR-100+Betulinic acid反而恢复了 p-p65和ULBP2的抑制作用并下调IκBα的表达（P<0.05）,但对TLR4的表达无影响。AUR-100抑制TLR4/NF-κB后,共同培养系统中CD3-CD56+的NK细胞比例极为显著地上调（P<0.05）。而重新激活TLR4/NF-KB后共同培养系统中CD3-CD56+的NK细胞比例增加一倍多（P<0.05）。AUR抑制TLR4/NF-κB后Hela细胞中CD44V6的表达降低（P<0.05）,而当再次激活TLR4/NF-κB后Hela细胞中CD44V6的表达增加（P<0.05）,且细胞中OCT4、OPN、CD133的表达水平增高（P<0.05）。而且,当联合AUR和TLR4/NF-κB的抑制剂刺激Hela细胞时,细胞中CD44V6的表达水平比单独AUR处理还要低（P<0.05）,且细胞中OCT4、OPN、CD133的表达同样更低于AUR单独处理（P<0.05）。结论:AUR通过抑制TLR4/NF-κB信号通路干预宫颈癌免疫逃逸和宫颈癌细胞的“干性”特征。实验五飞龙掌血醇提物对宫颈癌细胞生长和转移的影响初步研究目的:探讨飞龙掌血醇提物（ATR-ET）对宫颈癌细胞的增殖活性、凋亡、转移的调控作用。方法:使用ATR-ET（ATR-ET组）、ATR-ET的10倍稀释液（ATR-ET1组）、ATR-ET的100倍稀释液（ATR-ET2组）处理培养的Hela细胞24 h,对照组为不进行任何处理。宫颈癌K-8法检测细胞的存活率的变化,另外,Hoechst-PI染色观察细胞凋亡和坏死情况,使用基质胶Transwell细胞侵袭实验分析检测的侵袭能力变化。Western蛋白免疫印迹法和细胞免疫组织化学法检测细胞中E-钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Viminten）、Twist-1等细胞侵袭和EMT相关蛋白的相对表达水平。结果:与对照组比,ATR-ET2、ATR-ET1、ART-ET2可明显降低Hela细胞的存活率,并促进了细胞的凋亡水平和细胞坏死率（P<0.05）,抑制细胞的侵袭率。另外,研究发现,ATR-ET可以上调了 E-cadherin的表达水平（P<0.05）,并抑制Viminten和Twist1的表达水平（P<0.05）。结论:ATR具有抑制宫颈癌细胞生长和转移的潜力。总结:1.飞龙掌血单体AUR具有抑制CC细胞的细胞生长和迁移的作用,并有剂量依赖性。2.飞龙掌血单体AUR有促进NK细胞的介导的免疫杀伤作用,并调节免疫细胞因子IL-2、INF-γ、TNF-α及PD-L1表达;3.飞龙掌血单体AUR对CD44V6（+）CC细胞的“干性”特征（OCT4,OPN,CD133表达和成球能力）具有抑制作用;4.飞龙掌血单体AUR通过抑制TLR4/NF-κB信号通路调节CC细胞的免疫逃逸作用和CD44V6（+）CC细胞的“干性”特征;5.飞龙掌血醇提物对CC细胞的生长和侵袭具有明显的抑制作用。