研究背景:在我国,恶性肿瘤已经成为一个严重的公共卫生问题。其中肺癌(Lung cancer)是我国发病率、死亡率最高的恶性肿瘤,且近年来仍呈上升趋势。根据我国肿瘤年度报告,2000年至2014年间,肺癌总体发病率呈上升趋势,2014年肺癌估计新发病例78.1万,发病率为57.13/10万;同时,估计死亡病例数为62.64万,死亡率为45.8/10万,居同期恶性肿瘤死亡原因第一位。非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌中最常见的病理类型,早期缺乏特异性症状,导致约2/3的患者在诊断时即已是晚期阶段,失去了手术机会,尽管目前的治疗手段包括化疗、放疗、靶向、免疫治疗等取得了极大的进展,然而由于肿瘤细胞的异质性和基因组不稳定性,这些治疗也仅能让少部分患者受益,且依然容易产生耐药、复发,5年生存率仍未取得重大突破。目前,对于肺癌的发病机制仍然不十分清楚。肺癌突变论坛(lung cancer mutation consortium,LCMC)研究发现约2/3的进展期肺癌病例中至少检测出一种驱动突变基因的存在~3,开发针对这些靶点基因的药物可以改善部分肺癌患者的预后,目前已有的靶向药物针对靶基因突变的优势人群就显示了良好的疗效。因此,如能寻找到新的驱动基因,就有可能为解决部分肺癌患者的治疗窘境。高迁移率族(High mobility group,HMG)蛋白是一类含量丰富、进化高度保守的非组蛋白染色体蛋白,因其在电泳时有很高的迁移率而得名,该蛋白家族成员广泛存在,数量丰富,可结合到DNA或核小体上来诱导染色质结构的变化,对于染色体动力学和染色体中DNA转录、翻译等进程具有十分重要的意义。HMGs分为经典的HMG蛋白和非经典的HMG蛋白。经典的HMG蛋白发现较早,可分为HMGA(High mobility group A protein),HMGB(High mobility group box protein)和HMGN(high mobility group nucleosome)三个亚族,分别通过“AT-hooks”、HMG盒结构域、核小体结合结构域结合到DNA或核小体上,参与染色体DNA的复制、转录、翻译、表观遗传学修饰等。非经典的HMG家族成员包括HMGXB3(HMG-box containing 3),HMG2L1(high mobility group 2 like 1),HMG20A,HMG20B四位成员,均发现较晚,目前研究的也较少。经典的HMG蛋白都发现与肺癌有一定的相关性,尤其是研究最深入的HMGB1参与了肺癌的发生、转移甚至化疗药物耐药,那同样含有HMG盒结构域的HMG2L1是否在肺癌的发生发展中发挥作用呢?基于此设想,本研究首先探索性的采用免疫组织化学法检测了肺癌外科切除手术标本中癌组织和癌旁组织中HMG2L1的表达水平,发现癌组织中HMG2L1的表达水平较癌旁组织明显升高,随后我们进一步扩大样本量进行检测,并分析HMG2L1的表达水平与肺癌患者临床特征的关系;同时,我们在细胞水平探索HMG2L1的肺癌发生发展中的功能及可能的作用机制,采用shRNA干扰HMG2L1的表达,并研究其对肺癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响,并初步探索了可能的机制。研究目的:1.了解HMG2L1在非小细胞肺癌的表达及与临床特征和预后的关系;2.探索HMG2L1在非小细胞肺癌的作用及可能的机制。实验方法:1.肺癌组织检测HMG2L1表达:收集外科手术切除的肺癌组织石蜡标本,采用免疫组织化学法检测HMG2L1的表达,采取H-score评分方法进行半定量评分。同时收集入组病例的基线临床资料,包括:性别,年龄,吸烟状况,合并疾病,肿瘤大小,淋巴结转移,远处转移,临床分期,病理组织分化程度等,并按期进行随访。分析HMG2L1的表达水平与患者临床资料的相关性(统计学方法采用卡方检验)以及生存预后的关系。2.细胞实验:(1)细胞培养:从ATCC细胞库购买人类NSCLC细胞系A549及H1299细胞,采用含10%血清,青霉素、链霉素的RPMI1640培养基,在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱培养,待细胞生长至90%融合时进行胰蛋白酶消化传代,按2×10~5/ml的接种密度接种到新培养瓶中分瓶培养,每2-3天传代1次。(2)构建HMG2L1-shRNA慢病毒载体:根据人HMG2L1基因序列,通过网站设计3对干扰序列,交由公司合成并构建质粒载体,测序分析验证,包装成慢病毒,并转染至A549细胞中,qRT-PCR法检测转染效率,选取最佳干扰序列病毒进行扩增,获得HMG2L1-shRNA慢病毒载体。(3)转染HMG2L1-shRNA慢病毒:将HMG2L1-shRNA慢病毒转染至A549细胞和H1299细胞,转染72小时后提取细胞的蛋白及RNA,采用Western blot法和qRT-PCR法鉴定转染效率。(4)建立稳定细胞表达细胞株:将转染了HMG2L1的A549细胞和H1299细胞加入预先摸索好浓度的含杀稻瘟菌素的培养基中进行筛选,反复换液传代,筛选后的细胞株采用Western blot法和qRT-PCR法鉴定HMG2L1的表达;(5)细胞功能检测:1)增殖实验:将转染对照/HMG2L1-shRNA慢病毒的A549细胞和H1299细胞接种于24孔板上,种板后第2,4,6天采用结晶紫染色法进行染色后在酶联免疫仪上检测595nm波长测定各组细胞的吸光值,根据吸光值绘制生长曲线,计算细胞增殖率;2)划痕实验:将转染对照/HMG2L1-shRNA慢病毒的A549细胞和H1299细胞接种于6孔板上,待细胞生长至90%融合时进行划痕,每12小时观察细胞迁移情况,拍照记录,并采用ImageJ软件计算划痕面积;3)侵袭实验:采用Transwell小室法,将Matrigel胶均匀铺于小室内层底部,将转染对照/HMG2L1-shRNA慢病毒的A549细胞和H1299细胞悬液接种至小室里面,用含1%FBS培养基饥饿24小室后,将小室外面替换成10%FBS完全培养基,在37℃培养箱中孵育24小时后取出小室,对小室底部外侧的细胞进行固定、染色,拍照计算细胞的数量;(6)细胞信号通路研究:将转染对照/HMG2L1-shRNA慢病毒的A549细胞和H1299细胞接种至6孔板,待细胞生长至80%融合时收集细胞提取总蛋白,采用Western blot法检测细胞信号通路相关蛋白的表达。3.统计分析:采用prism 6.0软件进行数据统计分析,数值变量用均数±标准差表示,两组间比较应用独立样本t检验,多组间的比较采用单因素方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA)。分类变量用百分率表示,组间比较采用卡方检验(chi-square检验)。P<0.05表示具有统计学差异。实验结果:1.HMG2L1在非小细胞肺癌的表达及临床意义:(1)非小细胞肺癌患者肺癌组织及癌旁组织HMG2L1表达情况:共收集并检测了60对癌组织及癌旁组织标本,二者的HMG2L1检测水平分别为:癌组织的H-SCORE评分176±4.71,癌旁组织的H-SCORE评分为84.68±4.713,差异具有统计学意义(P<0.0001)(2)肺癌组织HMG2L1的表达水平与临床病理特征的关系:以癌组织样本中H-score评分的中位数(179.8)为界值,将肺癌组织HMG2L1表达分为低表达组(≦179.8)和高表达(>179.8)组,结果显示HMG2L1的表达水平与患者的性别、年龄、吸烟状况、肿瘤大小、病理类型、有无淋巴结转移无明显相关性,而与病理组织的分化程度、临床分期相关,HMG2L1的表达水平越高,则病理组织的分化程度越低,临床分期越晚;采用t检验进一步分析各临床特征分组中HMG2L1的表达水平,发现HMG2L1的表达水平可能与性别、吸烟与否、病理类型有一定的相关性。(3)截至2020年3月30日,60例患者中,平均随访时间为16.2月(7-21月)。60例患者中,38例患者术后未接受放化疗等肿瘤相关治疗(38/60,63%),22例(22/60,37%)患者接受了1-8次不等周期的的化疗。出现疾病进展12例(12/60,20%),其中死亡4例(4/60,6.7%)。12例疾病进展患者的的H-score评分为190±5.359,IA期2例(2/60,3.3%),IB期2例(2/60,3.3%),IIA期3例(3/60,5%),IIIA期3例(3/60,5%),IIIB期2例(2/60,3.3%);4例未进行术后化疗(4/60,6.7%),8例进行了术后化疗(8/60,13.3%)。4例死亡患者的平均H-score评分200.6±5.086,IIA期1例(1/60,1.7%),IIIA期2例(2/60,3.3%),,IIIB期1例(1/60,1.7%),IIA期患者未接受化疗,其他3例均接受了化疗。截至目前随访时间,HMG2L1的高表达可能与生存预后不良相关(P<0.05),暂时未发现两组无病生存期(DFS)的差异(P>0.05)。2.HMG2L1在非小细胞肺癌的功能及机制:(1)所筛选的3个引物序列中HMG2L1-shRNA-VL1222可以显著敲低HMG2L1,将该慢病毒转染A549细胞及H1299细胞,再通过BSD筛选成功获得了HMG2L1干扰的细胞系,经qRT-PCR和Western Blot验证转染后HMG2L1的基因和蛋白表达显著下调;(2)HMG2L1对非小细胞肺癌细胞增殖的影响:在A549细胞中敲低HMG2L1后细胞增殖率下降,且在接种的第6天具有显著差异(P<0.001);在H1299细胞中敲低HMG2L1后同样出现细胞增殖率下降,且在接种的第6天具有显著差异(P<0.001)。对比两株细胞HMG2L1后的增殖率,A549细胞下降的似乎要明显些。(3)HMG2L1对非小细胞肺癌细胞迁移的影响:细胞划痕实验结果结果显示,A549细胞迁移较慢,需要近68-90h划痕才充分闭合;H1299迁移速度较快,36小时细胞即可迁移到对侧。转染HMG2L1-shRNA的A549细胞和H1299细胞迁移速度均较对照组慢,差异具有统计学意义(P<0.01)。(4)HMG2L1对非小细胞肺癌细胞侵袭的影响:Transwell小室实验结果显示在A549细胞敲低HMG2L1可使细胞的侵袭能力显著下降(P<0.01),而在H1299中,转染HMG2L1-shRNA的H1299细胞穿过基质胶的能力显著下降(P<0.01)。(5)HMG2L1在非小细胞肺癌细胞中的作用机制探索:在A549细胞和H1299细胞中敲低HMG2L1后,虽然β-catenin和Wnt5a略有上升趋势,但并没有统计学意义(P>0.05),STAT3表达也未见明显变化,这可能提示了人HMG2L1在非小细胞肺癌细胞的功能并不是通过Wnt信号通路和STAT3而发挥作用,因此,HMG2L1在非小细胞肺癌的作用机制有待进一步探索。结论:1.在非小细胞肺癌患者中,HMG2L1的表达在肺癌组织中明显高于癌旁组织;2.HMG2L1的表达水平与非小细胞肺癌病理组织的分化程度、临床分期相关,HMG2L1的表达水平越高,则病理组织的分化程度越低,临床分期越晚;同时,也可能与性别、吸烟与否、病理类型有一定的相关性,男性、吸烟、鳞癌的表达水平较高。3.HMG2L1的表达水平可能与非小细胞肺癌患者的生存预后相关,HMG2L1的表达越高,总生存期越短。目前尚未发现HMG2L1的表达水平与无病生存期的相关性。4.HMG2L1可以促进非小细胞肺癌的增殖、迁移、侵袭,可能参与了肺癌的发生和转移。5.HMG2L1在非小细胞肺癌的作用机制可能与Wnt信号通路分子β-catenin、Wnt5a及STAT3无关,可能通过其他的信号通路发挥作用。