论文部分内容阅读
近几年,嵌合抗原受体(CAR)免疫疗法在B细胞恶性肿瘤的临床研究中展现出非常好的临床疗效,但是,针对T细胞肿瘤的CAR-T疗法仍然面临着很大的挑战,我们很难找到一个针对T细胞肿瘤的合适靶点,大部分在T细胞肿瘤细胞上高表达的抗原,在正常T细胞上也会表达,这会导致CAR-T细胞产生自相残杀的现象。CD7分子在大部分的T淋巴细胞白血病细胞中是高表达的,但在一小群正常T淋巴细胞中是不表达的,有研究表明CD7不会对T细胞的发育和功能产生关键的影响。暗示CD7分子可能是T淋巴细胞白血病的一个理想靶点,但是,由于CD7分子在大部分正常T细胞上也表达,在制备过程中CD7-CAR-T细胞也会产生自杀现象,因此在体外很难制备成功。另外,我们也很难从T淋巴细胞白血病患者的体内获得足够的没有被肿瘤细胞污染的正常T细胞来制备CD7-CAR-T细胞。虽然最近有报道显示,在动物模型中,可以通过同时敲除了CD7和T细胞受体的异体CD7-CAR-T来治疗T细胞恶性肿瘤,但在临床实际应用中不能保证100%的基因编辑效率,因此,异体CD7-CAR-T仍然存在移植物抗宿主病(GVHD)的风险。自然杀伤(NK)细胞在对抗恶性细胞的先天免疫防御中发挥着重要作用,也是过继性免疫治疗的理想效应细胞。NK-92细胞系来自于一名非霍奇金淋巴瘤患者外周血中的单核细胞,它是唯一的一株被批准用于临床试验的NK细胞系。NK-92MI细胞来自NK-92细胞系,通过稳定转染白细胞介素-2(IL-2)基因,使其不依赖于IL-2。在本课题中,我们使用我们实验室自主开发的CD7纳米抗体序列构建了单价的CD7-CAR-NK-92MI和二价的dCD7-CAR-NK-92MI细胞,靶向治疗T淋巴细胞白血病。目的:(1)使用我们实验室自主研发的CD7纳米抗体序列,构建靶向CD7的单价CD7-CAR-NK-92MI和二价dCD7-CAR-NK-92MI稳定细胞株;(2)体外检测CD7-CAR-NK-92MI和dCD7-CAR-NK-92MI细胞对CD7阳性肿瘤细胞的细胞毒性;(3)体外筛选2种CAR-NK-92MI细胞的单克隆细胞株,比较不同单克隆细胞株的细胞活性,获得细胞活性最好的一株CAR-NK-92MI单克隆细胞株(mdCD7-CAR-NK-92MI);(4)评估 mdCD7-CAR-NK-92MI 细胞对 T 淋巴细胞白血病细胞的体内抗肿瘤效果。方法:为了构建CD7-CAR-NK-92MI和dCD7-CAR-NK-92MI细胞株,我们首先设计、合成并构建了 CD7-CAR和dCD7-CAR表达质粒,通过电转方法构建了CD7-CAR-NK-92MI 和 dCD7-CAR-NK-92MI 细胞株,利用细胞流式和 western bloting 的方法对 CD7-CAR-NK-92MI 和 dCD7-CAR-NK-92MI 细胞进行了鉴定。然后通过CSFE/7AAD的体外杀伤方法,检测了 2种CAR-NK-92MI细胞对T淋巴细胞白血病细胞的体外细胞毒性。使用流式细胞分选仪进行了单克隆细胞的分选,并通过CSFE/7AAD细胞毒性检测方法和CBA细胞因子检测方法,比较了不同单克隆细胞的细胞活性,获得活性最好的单克隆细胞株(mdCD7-CAR-NK-92MI),最后通过T淋巴细胞白血病原代肿瘤细胞建立的小鼠模型,评估了mdCD7-CAR-NK-92MI细胞的体内抗肿瘤作用。结果:我们成功构建了单价的CD7-CAR-NK-92MI和二价的dCD7-CAR-NK-92MI 细胞株,CD7-CAR-NK-92MI 和 dCD7-CAR-NK-92MI 细胞对T细胞白血病细胞系和原代肿瘤细胞都显示出显著的抗肿瘤活性。通过细胞流式分选获得了 8种单价的CD7-CAR-NK-92MI单克隆细胞和6种二价的dCD7-CAR-NK-92MI单克隆细胞,并通过细胞毒性实验和细胞因子释放实验获得了活性最好的二价mdCD7-CAR-NK-92MI细胞株。我们观察到二价的mdCD7-CAR-NK-92MI单克隆细胞对原代T-ALL肿瘤细胞具有显著的细胞毒性。同时,我们也观察到,与对照NK-92MI细胞相比,mdCD7-CAR-NK-92MI细胞与CD7阳性的原代T-ALL细胞孵育后,有显著的干扰素γ和颗粒酶B的释放升高。小鼠实验的结果表明mdCD7-CAR-NK-92MI对PDX小鼠模型中的肿瘤细胞具行明显的抑制作用,显著延长了小鼠的生存期。结论:我们构建了基于CD7纳米抗体序列的CD7-CAR-NK-92MI和dCD7-CAR-NK-92MI细胞,并通过一系列的实验证明了对T-ALL肿瘤细胞的抗肿瘤效果。不仅通过体外实验证实了 CD7-CAR-NK-92MI和dCD7-CAR-NK-92MI细胞对T-ALL细胞系和原代肿瘤细胞的特异性细胞毒性,而且还通过动物实验证明了 mdCD7-CAR-NK-92MI细胞可以显著抑制T-ALL原代肿瘤细胞构建的异种移植小鼠模型中的肿瘤进展。总之,我们构建的CD7-CAR-NK-92-MI细胞为T淋巴细胞白血病的治疗提供了一种新的方法或策略。虽然CD19-CAR-T疗法在治疗B细胞恶性肿瘤,特别是B细胞急性淋巴细胞白血病取得了重大的进展,表现出惊人的临床疗效,但是用CD19-CAR-T治疗后的复发率依然很高,肿瘤复发的机制之一是肿瘤细胞可以通过下调肿瘤细胞表面CD19抗原的表达,来逃避CD19-CAR-T细胞的杀伤。解决CD19阴性复发的策略之一是使用靶向B细胞肿瘤细胞上其它分子的CAR-T细胞。除了 CD 19外,CD22、CD20、CD123也是靶向B细胞肿瘤的理想靶点。但类似于CD19,靶向单一抗原依然可能会出现由于抗原丢失导致的肿瘤逃逸。因此,构建可以同时靶向癌细胞上两个抗原的CAR-T细胞,可能是解决由于单抗原丢失导致的肿瘤复发的一种新策略。目的:(1)开发人源化的CD 19和CD20抗体序列,构建hCD 19-hCD20-CAR载体;(2)构建人源化的双特异 hCD19-hCD20-CAR-T细胞和hCD19-hCD20-CAR-Jurkat细胞;(3)检测 hCD19-hCD20-CAR-Jurkat 细胞是否可以被CD 19阳性或CD20阳性靶细胞特异性活化;(4)评估hCD19-hCD20-CAR-T细胞对CD19过农达肿瘤细胞或CD20过表达肿瘤细胞的生物学功能;(5)评估hCD1 9-hCD20-CAR-T细胞对天然表达CD19和CD20抗原的B细胞肿瘤细胞株的生物学功能。方法:为了构建双特异的hCD19-hCD20-CAR载体,我们首先开发了人源化的CD19scFv和CD20scFv序列,然后设计、合成并构建了hCD19-hCD20-CAR表达质粒,并制备了 hCD19-hCD20-CAR慢病毒,对于T细胞或Jurkat细胞进行转染,制备hCD19-hCD20-CAR-T 细胞和 hCD19-hCD20-CAR-Jurkat 细胞株。我们通过检测与K562-CD19 或 K562-CD20细胞孵育后hCD19-hCD20-CAR-Jurkat 细胞表面CD69的表达情况,初步评估hCD19-hCD20-CAR是否可以被CD19或CD20抗原特异性激活。然后我们通过细胞杀伤实验检测了 hCD 19-hCD20-CAR-T细胞对K562-CD19,K562-CD20,K562-CD19-CD20,Raji,Nalm-6 细胞的细胞毒性,并通过检测细胞因子的分泌和细胞表面活化分子的表达,进一步验证了hCD19-hCD20-CAR-T是否可以被靶细胞特异性活化。结果:我们成功开发了人源化的CD19抗体和CD20抗体,获得了人源化的CD19scFv 和 CD20scFv 序列,构建了 hCD19-hCD20-CAR-T 细胞和hCD19-hCD20-CAR-Jurkat 细胞。hCD19-hCD20-CAR-Jurkat 细胞与 K562-CD19 或K562-CD20细胞孵育后,CD69有显著升高,而与K562细胞孵育后,hCD1 9-hCD20-CAR-Jurkat细胞表面CD69没有显著升高,说明我们构建的hCD19-hCD20-CAR-Jurkat细胞既可以被CD19阳性肿瘤细胞激活,也可以被CD20肿瘤细胞特异性激活。hCD19-hCD20-CAR-T细胞对K562-CD19和K562-CD20细胞的杀伤结果表明,我们构建的hCD19-hCD20-CAR-T对CD19阳性或CD20阳性的肿瘤细胞都具有特异性杀伤,可以同时杀伤CD19阳性肿瘤细胞或CD20阳性肿瘤细胞,此外,与K562-CD19和K562-CD20细胞孵育后,与T细胞组相比,hCD19-hCD20-CAR-T组的细胞因子释放有显著升高,CD25的表达也有显著增高,说明hCD19-hCD20-CAR-T细胞可以被K562-CD19或K562-CD20细胞特异性激活。hCD19-hCD20-CAR-T细胞对Raji细胞和Nalm-6细胞的体外功能实验结果也显示hCD19-hCD20-CAR-T细胞对Raji细胞和Nalm-6细胞也具有显著的特异性杀伤,而且hCD19-hCD20-CAR-T细胞也可以被Raji或Nalm-6细胞特异性激活。结论:我们成功构建了基于人源化CD19scFv和CD20scFv的hCD19-hCD20-CAR-T细胞,通过一系列体外实验证明了 hCD19-hCD20-CAR-T细胞对CD19阳性肿瘤细胞或CD20阳性肿瘤细胞都具有显著的靶向杀伤作用,因此我们构建的人源化hCD19-hCD20-CAR-T细胞可能可以作为一种靶向治疗B细胞肿瘤的新型治疗手段,或者作为CD19-CAR-T治疗后肿瘤复发的一种补救手段。