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群体感应(Quorum-Sensing)是一种自然界内广泛存在的微生物细胞与细胞之间信息交流的机制。本文利用海洋费氏弧菌(Vibrio fischeri)这一理想的模式菌,从解耦Vibrio fischeri ATCC7744群体感应机制入手,研究群体感应系统在控制菌体浓度方面的应用。
本课题组已利用群体感应系统关键基因lux.Box(包含启动子lux pR与lux pL)、luxR、luxI和致死蛋白基因ccdB在大肠杆菌中构建了一系列标准化的细胞浓度控制元件。在此基础上,本文着重对这些细胞浓度控制元件的调控性能进行表征,并在基因水平上,探索影响该体系调控效果的因素,所取得的主要结果有:
一、考察了不同细胞浓度控制元件的调控性能,实验结果显示,含有RBS效率为0.07的细胞浓度控制元件的工程菌能够对细胞浓度进行自我调控,相对于不含有该通路的菌株,该工程菌有更长的稳定期。采用活菌数计数的方法定量地揭示了RBS效率与稳定期细菌密度的密切关系:RBS效率越高其稳定期活菌数越低。RBS1.0、RBS0.6、RBS0.3、RBS0.07细胞浓度控制元件分别将细胞浓度调控于6.93×108、4.45×108、2.53×108、1.68×108 cfu.mL-1。提出了描述该细菌稳定期的活菌数与RBS效率之间关系的数学模型。
二、通过序列分析,对启动子luxpR活性中心的碱基进行定点突变和组合突变改造,突变启动子的启动效率得到不同程度的提高。我们首次定义了标准化群体感应启动子的启动效率。原启动子的启动效率为11.89％,而突变启动子luxpR3、luxpR5和luxpR35的启动效率分别为100％、56.54％和6.02％。将突变启动子引入细胞浓度控制元件中,分别将细胞浓度控制于2.50×108、1.75×108、1.25×108、2.25×108 cfu.mL-1。
三、初步建立了一种表征细胞浓度控制元件的方法。将报告基因gfp连接到细胞浓度控制元件下游,通过测定菌体荧光强度来表征元件工作性能。结果表明,菌体的荧光强度和活菌数有着密切关系。