脂肪酸结合蛋白(Fatty acid binding protein,FABP)是一类小分子蛋白质,约14~15 KD,能够与穿过细胞膜的长链脂肪酸紧密结合。脂肪酸结合蛋白3(Fatty acid binding protein 3,FABP3)又称心脏型脂肪酸结合蛋白(heart fatty acid binding protein,H-FABP),在心肌组织中高表达,参与了脂质和葡萄糖代谢维持心脏及身体其他部位的能量供应。生理状态下,FABP3能够将胞内长链脂肪酸转运至线粒体,产生ATP。FABP3过表达会导致ATP含量显著下降。当心肌缺血性损伤时,血浆FABP3浓度升高。研究指出,FABP3能够抑制大鼠心肌细胞的收缩,但是具体机制还不清楚。糖尿病患者往往并发心脏左室收缩功能障碍。胞内钙是心肌收缩性的主要调节者,糖尿病心肌细胞中钙平衡改变,钙稳态异常。伴随着严重的肌浆网钙流失,导致肌浆网内钙储备下降,心肌收缩力下降。钙离子从肌浆网释放到胞浆主要是通过RyR2,而SERCA则通过消耗ATP的方式逆浓度差回收钙离子进入肌浆网。Ry R2和SERCA密切配合,维持着肌浆网钙储备的动态平衡。经典理论认为SERCA活性的降低而导致的肌浆网钙储备不足是心衰的主要诱因。SERCA活性的下降直接导致肌浆网钙回收能力下降,降低肌浆网钙储备以及破坏正常的心肌细胞钙稳态(intracellular calcium homeostasis)。文献报道在STZ诱导的糖尿病大鼠模型中肌浆网钙储备显著性的下降,但其机制尚不明朗。ATP含量是影响SERCA活性的因素之一,心脏需要持续高水平的氧化代谢,以维持ATP产量。在健康的心脏中,近70%的ATP通过脂肪酸氧化产生,氧化磷酸化的速率与ATP水解的速度紧密相连,ATP含量稳定。在糖尿病中,心脏葡萄糖利用率下降,几乎完全依赖线粒体β氧化合成ATP。而过度的脂肪酸摄取对线粒体氧化会造成不利影响,线粒体解耦联增加导致ATP/O2比率降低。越多的脂肪酸氧化,消耗氧气越多,脂肪酸氧化需求增加,心脏效率减少进一步导致糖尿病心脏收缩功能障碍。那么在糖尿病心脏损伤中,FABP3发挥着怎样的作用,是否与心功能损伤相关?是否对钙信号、细胞收缩造成影响呢?为了探讨上述问题,本实验以糖尿病小鼠为动物模型,以急性分离的小鼠左室心肌细胞作为研究对象,进行以下三部分研究:一、以con和dm小鼠为实验对象,观察fabp3在心肌组织中的表达,分析小鼠心脏fabp3的表达与心功能损伤及线粒体功能的相关性。二、检测dm小鼠心肌细胞的收缩力、肌浆网钙储备、钙瞬变、钙火花等,外源给予fabp3刺激,证实fabp3使肌浆网钙储备降低,影响serca活性,钙火花发生变化,影响ryr2的活性,钙瞬变发生变化,抑制心肌细胞收缩。三、fabp3能够下调atp含量,进而影响serca活性,抑制心肌细胞收缩,fabp3的定位变化可能是影响serca和ryr2活性的因素之一。本研究旨在为糖尿病心肌病的发生发展提供新的视角,为糖尿病心脏损伤机制研究提供了实验依据和理论基础。第一部分糖尿病小鼠心肌fabp3的表达、分布以及对心功能影响目的:检测糖尿病小鼠心肌fabp3的表达变化、亚细胞定位,以及脂肪酸和葡萄糖氧化相关基因的表达,结合相关性分析评价fabp3与心功能损伤及atp的关系。方法:1利用链脲佐菌素(streptozocin,stz)诱导产生糖尿病模型小鼠。2检测小鼠体重、血糖、血压、血脂等指标,小动物超声检测心功能。3westernblotting检测fabp3的蛋白表达。4免疫荧光检测fabp3在小鼠心肌细胞中的亚细胞定位。5用spearmancorrelationtest对fabp3与ef%进行相关性分析。6扫描电镜检测dm小鼠的线粒体结构。7realtimepcr检测小鼠心脏鼠脂肪酸和糖代谢相关的基因mrna表达。结果:1小鼠糖尿病模型的建立stz注射后测定小鼠的生理指标,血糖>16.7mmol/l,体重下降,血脂增加,出现三多一少症状说明糖尿病模型构建成功。心功能检测显示,dm组小鼠射血分数显著下降,以上结果表明构成糖尿病心功能损伤。2dm组小鼠心肌atp含量下降与con(117±0.8μm)组相比,dm组(62±0.6μm)atp含量显著下降,p<0.01。3fabp3在dm组小鼠心脏组织中表达增加westernblotting检测结果显示dm组小鼠心肌fabp3的蛋白表达量及mrna水平均显著上升。提示,在糖尿病心肌组织中,fabp3的表达增加。4fabp3与心功能损伤及atp含量呈一定的相关性利用pearsoncorrelationtest方法,对fabp3的蛋白表达与atp含量进行相关性分析,结果显示,fabp3的表达与atp含量负相关(r2=0.5143,p<0.01)。fabp3和射血分数(ef%)进行相关性分析,结果可见,fabp3的表达量与ef%呈负相关(r2=0.6913,p<0.01)。5fabp3亚细胞定位改变。5.1fabp3入核增多免疫荧光染色可见,dm组小鼠心肌细胞中fabp3入核增多,为con组的1.89±0.05倍,具有显著差异,p<0.01。5.2fabp3与线粒体共定位增加fabp3和线粒体的共定位显示,与con组相比,在dm组小鼠心肌细胞中,fabp3与线粒体的共定位显著增加(71.17±5.80%vs.91.51±2.60%,p<0.05)。6脂肪酸及葡萄糖氧化相关基因表达改变qrt-pcr检测显示:dm组小鼠心肌中线粒体β氧化相关基因mcad、cpt-1α的表达没有显著变化,过氧化物酶体β氧化相关基因thla、dbp、aox1表达显著升高,葡萄糖氧化相关基因glut4、g6pc3表达下降;线粒体呼吸链相关基因atpsynthase、cytc没有明显改变;解偶联蛋白ucp2、ucp3表达增加。7dm小鼠心肌线粒体结构改变线粒体结构检测发现,与con组相比,dm组小鼠心肌线粒体结构改变,线粒体嵴融合严重,线粒体结构发生变化。小结:糖尿病鼠心肌中fabp3的表达增加,可能与其心脏收缩能力下降有关。目的:测定fabp3对心肌细胞收缩和钙信号的影响,探讨fabp3是否参与小鼠心肌细胞肌浆网钙释放的调控,明确该调控作用的靶点。方法:1利用ionoptix单细胞动缘检测系统(ionoptixvideo-basededge-de-tection)检测细胞的收缩功能。2利用钙成像技术,检测钙火花,钙瞬变、钙储备等钙信号的变化。3以快速灌流的方式给予细胞fabp3处理,测定fabp3对心肌细胞收缩和钙信号的影响。结果:1dm组小鼠心肌细胞收缩能力下降检测细胞的收缩功能显示,dm组小鼠心肌细胞收缩能力显著下降(4.38±0.81μmvs.2.57±0.26μm,p<0.05)。2dm组小鼠心肌细胞出现钙调控异常2.1dm小鼠心肌细胞钙瞬变动力学变化dm组小鼠钙瞬变幅度显著性降低(2.15±0.09f/f0vs.1.88±0.08f/f0,p<0.05)。dm小鼠心肌细胞中钙回收的时间常数显著性变大(0.068±0.006vs.0.094±0.008s,p<0.05)。钙瞬变中钙浓度到达顶点的时间(timetopeak)显著性的延长(25.92±1.99msvs.35.93±2.82ms,p<0.05)。2.2dm小鼠肌浆网钙储备显著性降低与con小鼠相比,dm小鼠肌浆网钙储备呈下降趋势(2.38±0.74f/f0vs.1.98±0.37f/f0,p<0.05)。2.3dm组小鼠心肌细胞钙火花增加。正常情况下,con组的钙火花频率很低,而dm的钙火花频率显著增加(0.90±0.44sparks/100μm/svs.2.63±0.52sparks/100μm/s,p<0.05)。钙火花幅度分析显示,dm组小鼠的钙火花幅度小于con组(0.84±0.04f/f0vs.0.71±0.02f/f0,p<0.01)两组小鼠的钙火花宽度没有明显改变,dm组小鼠钙火花长度显著增加(26.90±1.26vs.30.34±1.01,p<0.001.)3fabp3具有抑制心肌细胞收缩的作用。给予con组细胞50nmfabp3灌流,记录灌流前与灌流后的细胞收缩变化,与给药前相比,fabp3灌流后小鼠心肌细胞收缩能力显著性下降第二部分fabp3对心肌细胞收缩的抑制作用(4.38±0.31f/f0vs.1.49±0.16f/f0,p<0.05)。进一步的分析发现,与dm小鼠心肌细胞相同,fabp3造成的小鼠心肌细胞收缩力下降主要是通过降低心肌收缩速率导致的,而细胞收缩时程则未受到fabp3的影响。4fabp3破坏心肌细胞钙调控4.1fabp3影响小鼠心肌细胞钙瞬变将细胞灌流前记为con组,灌流后记为fabp3组。在fabp3存在时,小鼠心肌细胞钙瞬变幅度减弱(2.15±0.094vs.1.69±0.118,p<0.05);tau值减慢(0.068±0.006vs.0.146±0.175s,p<0.001);fabp3灌流前后,两组细胞到达顶点(timetopeak)的时间没有明显改变。对两组细胞的钙瞬变进行曲线拟合,将钙瞬变参数分别进行高度、基线的均一化处理(normalized),与con组细胞相比,在高度一致时,fabp3细胞的动力学参数变慢;在基线一致时,fabp3组细胞的钙瞬变幅度降低;取消normalized可见,fabp3组细胞除钙瞬变幅度变小,动力学参数变慢外,钙瞬变的基线也上升。4.2fabp3导致肌浆网钙储备下降咖啡因诱导,记录fabp3灌流前后的钙储备,结果显示:灌流fabp3后细胞肌浆网的钙储备显著下降(2.39±0.74f/f0vs.1.27±0.08f/f0,p<0.001)。4.3fabp3引起小鼠心肌细胞钙火花改变对fabp3灌流前后的钙火花进行分析,显示,外源给予fabp3灌流后,心肌细胞的钙火花频率增加(0.74±0.28sparks/100μm/svs.1.20±0.29sparks/100μm/s,p<0.05)。钙火花幅度显著降低(0.84±0.04f/f0vs.0.64±0.01f/f0,p<0.001),两组小鼠的钙火花宽度没有明显改变,fabp3组细胞钙火花长度显著增加(26.90±1.26vs.20.27±1.47,p<0.01)小结:1fabp3抑制心肌细胞收缩。2糖尿病心肌中,fabp3可能通过影响serca的活性调节钙瞬变动力学、降低钙储备抑制细胞收缩。3糖尿病心肌中,fabp3可能通过影响ryr2的活性,影响钙泄漏,调节钙信号及细胞收缩。目的:探讨fabp3是如何影响serca、ryr2活性的,进一步阐明fabp3在心肌细胞收缩障碍中的作用。方法:1以快速灌流的方式给予细胞fabp3处理。2利用atp测定试剂盒检测atp含量。3免疫荧光,分析fabp3与serca、ryr2的共定位。4利用dchf-da荧光探针检测细胞ros水平。结果:1fabp3下调atp含量测量细胞的atp含量,结果显示,fabp3孵育后,心肌细胞atp含量下降,推测,fabp3可能通过下调atp含量降低serca活性。2fabp3与serca的共定位下降免疫荧光染色结果显示:dm组的fabp3与serca共定位下降(80.22±3.55%vs.62.52±2.88%,p<0.01),提示,更多的fabp3离开了serca,可能会影响serca的活性。3fabp3与ryr2共定位下降fabp3与ryr2共定位分析显示,与con组相比,dm组小鼠心肌细胞fabp3与ryr2共定位显著下降(96.50±1.27%vs.79.38±3.70%,p<0.01)。提示fabp3离开ryr2,可能会影响ryr2的活性。4fabp3对ros的影响以急性灌流的方式给予0.5nmfabp3处理,灌流前后的ros变化结果显示:fabp3灌流细胞后,ros荧光减弱,可见,fabp3的加入没有产生更多的ros,提示,fabp3没有造成氧化应激的增加。小结:fabp3通过下调atp含量,影响serca活性,进一步抑制细胞收缩作用。fabp3的定位变化可能是影响serca和ryr2活性的因素之一。结论:1在糖尿病心脏中fabp3表达增加,其表达与心功能有相关性,与atp含量相关,进而表明其与线粒体功能有相关性。2fabp3是引起糖尿病状态下,serca活性下降,ryr2活性下降,钙储备下降,心肌细胞收缩下降可能的原因。第三部分fabp3调节肌浆网钙储备的机制3糖尿病状态下,FABP3可能通过下调ATP含量,抑制SERCA活性。