论文部分内容阅读
背景子痫前期（preeclampsia,PE）是妊娠特有的高血压疾病,严重危害母儿健康。螺旋动脉重铸不足导致的胎盘形成不良和氧化应激的过度激活被认为是PE发病的关键环节。铁死亡（ferroptosis）是一种新发现的程序性细胞死亡形式,特征为铁离子依赖的脂质过氧化。有研究报道滋养细胞铁死亡可能参与PE的发病,但具体机制仍不明确。微小RNA（micro RNA,miRNA）是重要的转录后调控因子,广泛参与包括铁死亡在内多种病理生理过程的调控。关于miRNA是否通过调控滋养细胞铁死亡参与PE发病的证据仍十分有限。目的探究铁死亡与早发型重度子痫前期（early-onset severe preeclampsia,EO-SPE）的相关性;筛选在PE发病中调控铁死亡的关键miRNA并明确其具体作用机制,为理解PE的发病机制提供新的视角。方法1.试剂盒法检测丙二醛（malondialdehyde,MDA）水平、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GPx）活性,免疫组织化学染色、western blotting检测铁死亡通路关键分子蛋白表达水平,比较正常孕妇和EO-SPE胎盘铁死亡水平。2.通过Erastin诱导滋养细胞铁死亡,CCK8法检测细胞活力变化,筛选铁死亡相对敏感滋养细胞系进行后续研究;miRNA测序筛选滋养细胞铁死亡模型中差异表达的miRNA并行q RT-PCR验证测序结果;q RT-PCR检测两组胎盘中滋养细胞铁死亡相关miRNA的表达水平,确定可能参与PE发病的铁死亡相关miRNA。3.通过过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）构建滋养细胞氧化应激模型。CCK8法检测不同死亡类型抑制剂对H2O2或Erastin介导滋养细胞活力下降的影响;MDA试剂盒和C11-BODIPY染色法检测脂质过氧化水平,Mito TrackerTM标记线粒体膜电位,western blotting检测铁死亡通路关键分子蛋白表达水平,评估H2O2诱导的滋养细胞氧化应激模型中铁死亡的水平。4.通过转染mimic,inhibitor干预miR-7641功能,CCK8法检测细胞活力;MDA试剂盒和C11-BODIPY染色法检测脂质过氧化水平,western blotting检测铁死亡通路关键分子蛋白表达水平,评估miR-7641对PE模型中滋养细胞铁死亡的调控作用。5.Target Scan预测miR-7641靶基因;双荧光素酶报告基因实验验证miR-7641与靶基因的靶向关系;q RT-PCR、western blotting检测干预miR-7641后靶基因表达变化。转染过表达质粒阻断miR-7641对靶基因的调控作用。CCK8法检测细胞活力;MDA试剂盒和C11-BODIPY染色法检测脂质过氧化水平,western blotting检测铁死亡通路关键分子蛋白表达水平,评估靶基因对miR-7641介导的铁死亡调控作用的影响。6.通过转染mimic,inhibitor干预miR-7641功能,CCK8法检测增殖能力,FITC Annexin V/PI双染法检测凋亡水平;transwell法检测迁移及侵袭能力,评估miR-7641对滋养细胞生物学行为的影响。结果1.EO-SPE胎盘铁死亡水平较对照组升高。2.JAR细胞系对铁死诱导剂Erastin敏感。Erastin诱导miR-3178、miR-3195、miR-7641的差异表达,其中miR-7641在EO-SPE胎盘中表达降低。3.H2O2诱导的滋养细胞氧化应激模型中存在过度铁死亡。4.miR-7641 mimic可抑制H2O2诱导的滋养细胞铁死亡,反之miR-7641inhibitor可加剧H2O2诱导的滋养细胞铁死亡。5.Cullin 3（CUL3）是miR-7641的靶基因,CUL3质粒与miR-7641 mimic共转染可解除miR-7641 mimic抑制的CUL3表达,逆转其对核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-like 2,NFE2L2/Nrf2）表达的上调及铁死亡抑制作用。6.miR-7641 mimic可抑制滋养细胞凋亡,促进其侵袭及迁移;反之miR-7641inhibitor可促进滋养细胞凋亡,抑制其侵袭及迁移。结论miRNA-7641通过靶向CUL3/Nrf2负调控滋养细胞铁死亡,此外miRNA-7641抑制滋养细胞凋亡,促进其迁移及侵袭。低表达的miRNA-7641可能通过诱导滋养细胞铁死亡和对其生物学行为的调控,促进EO-SPE的发生发展。