川牛膝为川产道地常用中药,来源于苋科杯苋属多年生草本植物川牛膝Cvathula officinalis Kuan的干燥根。目前主要面临品质下降、品种混杂、产地变化等现状。本课题通过收集各主要产区川牛膝及其混淆品种以及野生川牛膝样品,从资源、药材性状、成分等方面进行质量分析,·明确其质量地理变异情况：通过叶绿体matK基因序列、ITS序列及SSR分子标记方法,分析川牛膝遗传多样性,应用系统发育分析软件以及谱系地理学分析方法对川牛膝的网状进化及谱系地理格局进行分析。结合质量地理区划与谱系地理格局对川牛膝质量差异进行深入解析,探讨质量差异形成的原因及机制。1.川牛膝质量地理变异格局分析对川牛膝各主要产地生态环境因子比较发现,四川金口河、雅安宝兴县、天全县等目前川牛膝的主要产区与重庆、湖南、湖北逐步形成规模的产地相比,所考察的气候、土壤、海拔等环境因子均比较接近,初步推测生态环境不是造成质量差异的主导因素。从川牛膝药材性状分析,可见不司的产地的川牛膝均表现为药材呈圆柱形,主根明显,分枝少,味甜,其区别主要在药材的直径。川牛膝与混淆品的区别主要是根的分枝数、味道以及颜色。在味道方面,川牛膝味甜,杂牛膝、麻牛膝均为甜味,略苦涩,味麻,土牛膝则味较淡。基于传统的经验判断川牛膝则以“条粗壮,分枝少,质韧,断面浅黄色,味甜”为件。采用智能感官电子舌系统对不同产地、不同年限、市售川牛膝药材及其混淆品进行“味道”分析,通过其响应值的差异可判定样品的产地、年限以及是否存在混淆。通过电子舌分析发现,药材的采收年限对其“味道”差异影响较大,同时验证了传统经验里“口尝”是否具有甜味来判定正品川牛膝的方法。川牛膝具有特殊的次生构造,不同产地的川牛膝在木栓层组成细胞列数、中央次生构造维管系统上较为明显的差异。川牛膝及其混淆种的差异主要在木栓层与三生维管束。对不同年限川牛膝的的三生维管束轮数进行观察,结果可见随着根生长年限的增长,其三生维管束轮数、个数均逐步增加,三年生与四年生川牛膝其三生维管束轮数可达4-10轮,每轮有10-60个三生维管束,较一年生、二年生川牛膝维管束轮数及每轮维管束个数多。通过杯苋甾酮含量分析可知,不同产地川牛膝杯苋甾酮含量存在一定差异,同时川牛膝杯苋甾酮含量较其混淆品种高。通过不同年限川牛膝样品比较,其含量随着生长年限的增长不断增加,达到三年后其增幅减小,趋于稳定。湖南、湖北、重庆等地川牛膝采收年限通常为1-2年,其杯苋甾酮含量变化较大：而四川地区川牛膝采收年限为三年及三年以上,质量趋于稳定。因此,采收年限是影响川牛膝成分含量差异的重要因素之一。市售药材测定结果显示所购买的六批市售川牛膝药材中仅两批药材含量达到标准,说明目前市售川牛膝药材质量不佳,市场监管力度有待提高。不同产地川牛膝其指纹图谱相似度在0.889～0.974,其相似性较高。通过聚类分析发现,川牛膝的生长年限对指纹图谱相似性影响较产地不同的影响更明显。2.基于SSR的川牛膝遗传多样性分析SSR为简单序列重复,因其重复序列的数目或重复程度不同而呈现出多态性,本实验采用SSR对川牛膝遗传多样性进行分析。从苋科植物39197条EST序列中共筛选出286个SSR位点,其SSR重复类型以二核苷酸重复基元类型最多,占90.56%。通过实验发现川牛膝SSR多态性位点共有6个,其PIC的平均值为0.2946,说明川牛膝的各位点为中度多态性位点。居群间的遗传分化系数Gst值为0.8623,表明居群变异占川牛膝遗传变异整体的86.23%,而居群内变异则占整体变异的13.77%,说明川牛膝的遗传分化在居群间部比居群内更为丰富。3.川牛膝分子谱系地理解析分子谱系地理学以研究遗传谱系空间分布的历史特征核心。叶绿体基因及核糖体DNA内转录间隔区（ITS）因其在功能上的限制较少,进化速率较快,常被用于分子谱系地理学研究。本实验基于叶绿体matK基因和ITS序列对川牛膝目前的地理分布格局及其遗传多样性进行了探讨。川牛膝基于叶绿体matK基因共有4种单倍型,通过居群的遗传分化结果可知Nst值小于Gst值,表明川牛膝各单倍型在分布上没有显著的谱系地理结构。推测其原因可能是由于在最初引物设计时序列的选择造成了样品分布主要集中于单倍型Hap₁和Hap₂。从系统进化树以及网状进化关系图可见,单倍型Hap₃和Hap₄单独聚为一类,二者分别对应四川峨眉麻牛膝和湖北恩施麻牛膝,麻牛膝为川牛膝常见混淆种,通过以上分析可知麻牛膝虽与川牛膝均属苋科杯苋属植物,但在亲缘关系上存在一定距离。川牛膝基于ITS序列共有单倍型24种,居群间遗传分化系数Nst值较Gst值大,表明川牛膝的24种单倍型间有显著的谱系地理结构。从各单倍型分布分析,单倍型Hap9分布地区为湖北、四川（金口河、峨眉）,其它各单倍型的分布均对应不同的地区。四川地区单倍型类型丰富,共分布有18种单倍型,占单倍型总体的75%。从系统进化树以及网状进化关系图结合各单倍型对应的样品的地理位置进行地理格局分析,可将其分为三个部分：（1）第一个部分,为网状进化关系最上端部分,主要由湖南、湖北、重庆、四川部分地区的样品所对应的单倍型组成,从地理位置分析可知,以上几个省份地区所呈现的分布情况为四川盆地及盆地周边地区,地理位置相近,其样品亲缘关系较为接近：（2）第二个部分,为网状进化关系中间部分,该部分主要由四川天全、宝兴、金口河、米易、荥经地区样品所对应的单倍型组成,可见四川天全、宝兴、金口河的样品与米易、荥经等地样品亲缘关系较近,而在前期的资料查询及实地调查中发现,四川不同产区都曾有过大规模引种,天全县在1976年为了扩大种植规模,从西昌调进了一大批种子,后来宝兴,金口河地区均从天全引种,因此该研究结果印证了曾经在上述地区发生的引种事件。（3）第三个部分,为网状进化关系图的左下侧分支部分,由单倍型Hap₁7、Hap₇和Hap₂3组成。其中Hap₇和Hap₂3单独聚为一类,二者分别对应四川峨眉麻牛膝和湖北恩施麻牛膝,该结果与叶绿体matK基因分析结果一致。Hap₁7对应的样品为四川金口河杂牛膝,从两种进化关系图中均可见该单倍型介于川牛膝和麻牛膝对应的单倍型之间,杂牛膝是川牛膝与麻牛膝的杂交种,其在亲缘关系上与二者的距离均相近。通过川牛膝遗传多样性分析发现,基于叶绿体matK基因和ITS序列分析,其居群分化系数系数Fst值分别为0.5763、0.7860（P<0.01）,表明川牛膝的遗传变异有57.63%、78.60%来自居群间,二者的结果均显示川牛膝居群间的遗传多样性较居群内部丰富。而居群的遗传多样性形成的因素有很多,繁殖方式、生态地理环境以及基因交流等因素。川牛膝为异花授粉,加大了川牛膝不同居群间、物种间的基因交流：川牛膝分布的地理范围较为广泛,各地生态环境、种植栽培方式等等均存在差异：随着川牛膝种植、栽培历史积累,川牛膝的产地发生一定的迁移,综合以上几方面的因素致使川牛膝的遗传多样性越来越丰富。