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第一部分Sac-1+心脏间充质细胞来源的外泌体的分离和鉴定目的:分离、纯化Sca-1+心脏间充质细胞来源的外泌体,并进行鉴定。方法:取野生型的C57BL/6小鼠的心脏,用两步法获得Sca-1+心脏间充质细胞。先用磁珠分选去除含有造血细胞表面标记的细胞,再用Sca-1标记的磁珠进行二次分选获得Sca-1+心脏间充质细胞(CMCs)。通过流式细胞学分析CMCs的表面抗原如CD105、CD44、CD140和c-kit,同时应用免疫荧光染色分析细胞GATA4和Ki67的表达。使用去除外泌体的含有10%FBS的培养基培养CMCs48小时,收集培养液,经沉淀法获得外泌体。使用免疫电镜和纳米颗粒示踪分析法对所得外泌体进行鉴定,进一步提取外泌体蛋白,通过Western blot检测CD63、CD81和Tsg101等在外泌体蛋白中的表达。结果:经上述方法获得Sca-1+心脏间充质细胞,经流式细胞学分析发现细胞CD105+、CD44+、CD140+、和c-kit+的细胞比例分别为86%,91%、65%、和6.8%;免疫荧光染色证实大多数心脏间充质细胞是GATA4+的,具有持续增殖更新能力。使用沉淀法可获得来源于Sca-1+心脏间充质细胞的外泌体(CMC-Exo),经免疫电镜分析和纳米颗粒示踪分析显示所得的细胞外囊泡平均直径约120nm,符.合外泌体的特点。Western blot实验也进一步证实其含有外泌体特征性蛋白如CD63,CD81和Tsg101。结论:来源于Sca-1+CMCs的细胞外囊泡经分离、纯化,经鉴定符合外泌体的特点。第二部分CMC-Exo对小鼠心肌梗死模型的保护作用目的:通过在体实验评估并证实CMC-Exo对小鼠心肌梗死模型的保护作用。方法:取15只2-3月C57BL/6雌性小鼠建立心肌梗死模型,结扎左前降支近段,在缺血的边缘区经心肌内注射CMC-Exo(30 μl,50μg,n=8)或者等体积PBS(n=7)在术前、术后24h和术后一月行超声心动图检查评估心功能。术后一月安乐死动物,心脏标本被固定、脱水和制作冰冻切片。应用Masson’s trichrome染色分析心肌梗死的范围和室壁厚度,组织免疫荧光染色检测EdU、CD31、Ki67和TNI的表达和分布,使用Image J软件计数单位面积心脏组织内CD31+毛细血管数,计算心梗边缘区的血管密度结果:成功建立稳定的心肌梗死模型。行超声心动图检测和分析,结果发现CMC-Exo可明显改善心肌梗死,后一月的左室射血分数;心脏组织Masson’s trichrome染色及免疫荧光染色结果显示与PBS组相比,外泌体治疗一个月后心肌梗死的范围明显减小,梗死区的室壁厚度显著高于PBS组;心肌梗死边缘区CD31染色阳性率明显增加。在梗死区和边缘区EdU+或Ki67+细胞显著增加,免疫荧光染色显示多为内皮细胞的增殖,同时发现外泌体治疗组存在较多的处于增殖期的心肌细胞。结论:研究发现CMC-Exo可明显改善心肌梗死后的左心功能,促进梗死边缘区内皮细胞和少量心肌细胞的增殖,增加血管密度,提示Sca-1+心脏间充质细胞来源的外泌体可促进血管新生第三部分CMC-Exo对小鼠下肢缺血模型的保护作用目的:通过在体实验评估并证实CMC-Exo对小鼠下肢缺血模型的保护作用。方法:取12只2-3月C57BL/6雌性小鼠建立左侧下肢缺血模型,左侧股动脉及分支被结扎后,在下肢缺血肌肉内注射CMC-Exo(30 μl,50 μg,n=7)或者等体积PBS(n=5)。在术前及术后1天,15天和28天行激光多普勒影像检查,评估与对侧相比下肢足掌的血流灌注。术后一月安乐死动物,肌肉标本被固定、脱水和制作石蜡切片。应用组织免疫荧光染色检测lectin的表达和分布,使用Image J软件计数单位面积的肌肉组织内lectin+毛细血管数,计算下肢肌肉的血管密度。结果:成功建立下肢缺血模型。行激光多普勒影像学检查和分析,结果发现CMC-Exo可明显促进术后2周和4周的下肢血流灌注的恢复;lectin免疫荧光染色结果显示CMC-Exo治疗组的下肢肌肉毛细血管密度高于PBS组(535.5 ±133.5/mm2 vs 479.0± 110.9/mm2),但两组无统计学差异。结论:研究发现CMC-Exo可明显改善下肢缺血后2周和4周血流灌注,但未显著增加术后一月下肢肌肉的毛细血管密度。第四部分CMC-Exo对缺血性心血管模型保护作用的体外实验研究目的:通过体外实验进一步探索CMC-Exo发挥保护作用的机制方法:应用CMC-Exo或等体积PBS干预人脐静脉内皮细胞(HUVECs),于37℃、5%CO2孵育20小时,通过成管实验观察微管网络的形成,并使用EVOS显微镜记录影像。使用Image J软件分析血管网络;予不同剂量CMC-Exo干预HUVECs24小时,应用Western blot检测PCNA、Erk等蛋白的表达;抽提CMCs和CMC-Exo的总RNA,应用基因芯片miRNA4.0 Array分析相对于CMCs而言,CMC-Exo内含miRNAs的构成和含量;为验证CMC-Exo注射后是否会增加肌肉内miRNA的水平,结扎小鼠左侧股动脉后经肌肉内注射50 μg CMC-Exo,右侧注射等体积PBS作为对照。术后24小时收集肌肉组织,提取总RNA,使用qPCR检测相应miRNA的表达。应用TargetScan数据库及Funrich软件进行生物信息学分析。结果:HUVECs介导的成管实验结果显示CMC-Exo显著促进微管网络形成;不同剂量CMC-Exo干预HUVECs未见PCNA、Erk等蛋白表达增加;miRNA微阵分析结果显示相对于CMCs,CMC-Exo内富含最多的miRNA是miR-7116-5p;qPCR结果分析发现,肌肉内注射CMC-Exo后,miR-7116-5p在肌肉内的表达升高20倍,提示miR-7116-5p可以通过CMC-Exo转运至肌肉内;基因信息学分析提示miR-7116-5p可能负性调节泛素化,或参与GTP结合或ATP结合蛋白的活动。结论:体外实验的结果发现CMC-Exo具有显著促进HUVECs介导的微管网络形成;相对于CMCs,CMC-Exo内含量最丰富的miRNA是miR-7116-5p,后者可能通过抑制泛素化,或者参与ATP结合相关蛋白的调控过程发挥重要的作用。