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第一部分高氧对早产大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖和转分化的影响【目的】建立高氧细胞损伤模型,探讨高氧对早产大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)增殖和转分化的影响,为高氧肺损伤时肺泡化障碍及肺损伤修复机制的研究提供实验依据。【方法】原代培养早产大鼠(孕19～20 d)AECⅡ,于接种15 h贴壁并更换培养液后,随机分为空气组和高氧组。高氧组通入95% O2-5% CO2 10 min后置于370C、5%CO2培养箱中培养,空气组直接置于370C、5%CO2培养箱中培养。于培养后24、48及72 h,收获各组细胞。高氧对早产大鼠AECII转分化的影响:利用倒置相差显微镜和透射电镜观察细胞的形态变化;免疫细胞化学染色法检测AECⅡ特异性肺泡表面活性蛋白-C(SP-C)及肺泡Ⅰ型上皮细胞(AECⅠ)特异性蛋白水通道蛋白5(AQP5)的表达;RT-PCR和流式细胞术分别检测SP-C、AQP5 mRNA及蛋白的表达。高氧对早产大鼠AECII增殖的影响:利用血球计数板计数法对培养细胞计数;台盼蓝拒染法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞周期;免疫荧光法检测Ki67表达。【结果】空气组AECII在培养后其数目不断增加,高氧组给氧后48和72 h,细胞数目减少,细胞活力降低。高氧使G0/G1期细胞比例显著增多,S和G2/M期细胞比例明显减少。高氧组给氧后24、48及72 h,Ki67+细胞的表达率及荧光指数( FI )较相同时间点空气组均明显降低( P<0.05或P<0.01 )。同时,随着给氧时间延长,原代培养的AECⅡ伸展变平,失去其板层体及微绒毛,丧失AECⅡ的特性,获得AECⅠ样外观。伴随其形态学改变,AECⅡ逐渐停止表达其特异性蛋白SP-C,开始表达AECⅠ特异性蛋白AQP5。高氧组给O2后24、48及72 h,SP-C mRNA、SP-C+细胞的表达率及荧光指数较同时间点空气组明显降低( P<0.05或P<0.01 ),AQP5的上述指标在给O2后24及48 h则较空气组明显增加( P<0.05或P<0.01 ),给O2后72 h,AQP5的表达开始减弱,与同时间点空气组相比无明显差异(P﹥0.05)。【结论】(1)原代培养的早产大鼠AECⅡ暴露在高氧环境中发生G1期阻滞,Ki67表达减少,细胞增殖受抑,可能是高氧肺损伤肺泡化障碍发生的原因之一;(2)体外培养的AECⅡ可自然转分化,但暴露在高氧环境中其转分化明显加速,高氧诱导早产大鼠AECⅡ转分化在不成熟肺泡上皮细胞损伤修复中起重要作用。第二部分与成纤维细胞共培养下早产大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖与转分化的研究【目的】建立早产大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)与肺成纤维细胞(LF)共培养模型,观察与LF共培养下早产大鼠AECⅡ增殖与转分化的生物学特性,为进一步研究AECⅡ与LF在肺发育及肺损伤中的相互作用提供实验基础。【方法】分离、纯化并签定早产大鼠AECⅡ和LF,利用PCF插入式Millicell培养皿和6孔板构建AEC-LF共培养模型,AECⅡ以5×105/mL的密度接种到6孔板中,LF以1×106/mL的密度接种到PCF插入式Millicell培养皿中,以6孔板中不放入套皿单独培养的AECⅡ为对照。于单独培养和共培养后2 d和4 d,利用倒置相差显微镜观察AECⅡ形态和基本生长情况;血球计数板计数各组不同时间点细胞数;台盼蓝染色检测细胞活力;RT-PCR和流式细胞术分别检测肺泡表面活性蛋白-C(SP-C)、水通道蛋白5(AQP5)mRNA及蛋白质表达;流式细胞术检测细胞周期及Ki67表达。【结果】(1)成功构建出早产大鼠AECⅡ和LF共培养模型,倒置相差显微镜下观察细胞活力可。(2)AECⅡ单独培养4 d,细胞分散生长,胞核伸展体积变大,核仁减少,部分转分化为AECⅠ样细胞;与LF共培养4 d ,细胞呈大的聚集样生长,细胞体积无明显增大,胞核仍呈圆形。与单独培养组相比,AECII与LF共培养2 d及4 d ,其SP-C mRNA及蛋白质表达明显增加(P <0.01),而AQP5 mRNA及蛋白质表达则明显减少(P <0.05或P <0.01)。上述细胞形态学及免疫标记物检测结果提示,与LF共培养时,AECⅡ能较好地保留其细胞形态,向AECⅠ转分化减少。(3)共培养2 d与单独培养2 d相比,AECⅡ的活力和细胞数目无明显差异。单独培养4 d,尽管AECII数目较单独培养2 d仍有增加,但增加幅度不明显,且细胞活力明显下降,而共培养4 d,AECII数目较单独培养4 d有明显增加,且(95.2±4.9)%的AECII台盼蓝仍拒染。与单独培养组相比,共培养2 d及4 d ,G0/G1期细胞均明显减少(P <0.01),而G2/M及S期细胞均明显增加(P <0.05或P <0.01),且表达Ki67+细胞的比率及荧光指数明显增加(P <0.01),说明与LF共培养时可促进AECII增殖。【结论】体外构建的早产大鼠AECⅡ与LF共培养模型,部分模拟了体内微环境。AECⅡ和LF共培养有利于保持AECⅡ的增殖和分化功能,可用于体外研究肺发育和肺损伤时AECⅡ和LF的相互作用。第三部分早产大鼠肺发育过程中SP-C和AQP5的动态表达及高氧的影响【目的】观察早产大鼠生后肺组织肺表面活性蛋白C(SP-C)和水通道蛋白5(AQP5)表达的动态变化及高氧的影响,探讨SP-C及AQP5在肺发育及肺损伤中的作用,为高氧肺损伤发生机制提供理论依据。【方法】剖宫术取出孕21 d (足月为22 d ) SD早产鼠,生后12～24 h内随机分为空气组和高氧组。高氧组持续暴露于85% O2中,空气组置于同一室内常压空气中。两组分别于暴露后1、4、7、10和14 d时,提取肺组织,采用免疫组织化学法对肺组织SP-C和AQP5表达定位,RT-PCR测定SP-C和AQP5 mRNA的表达,Western-blot法检测SP-C和AQP5蛋白表达。【结果】(1)早产大鼠生后不同时间肺组织均有SP-C表达,以生后1 d表达最明显,1 d以后在正常肺发育时下降,其阳性染色信号主要定位于AECⅡ。与同时间点空气组相比,高氧暴露1 d时,肺组织SP-C mRNA及蛋白表达显著降低(P <0.01),以后增加,高氧7 d增加最明显(p<0.01),高氧14 d时SP-C表达较空气组又减弱(p<0.05)。(2)早产大鼠生后肺组织AQP5表达不断增强,其阳性染色主要定位于AECⅠ。与同时间点空气组相比,高氧暴露1 d时,仅肺组织AQP5 mRNA表达显著高于对照组(P <0.05),而高氧暴露4、7、10及14 d时,其mRNA及蛋白表达均明显减少(P <0.05或P <0.01)。【结论】SP-C和AQP5参与了早产大鼠肺发育及高氧肺损伤的生理与病理过程;高氧暴露导致AQP5及SP-C表达下调是促使高氧肺损伤发生发展的重要因素。