论文部分内容阅读
帕金森病(Parkinson disease，PD)是一种常见的神经变性疾病，以中脑黑质多巴胺能神经元慢性进行性缺失以及残存的神经元胞浆内嗜酸性包涵体(Lewy体)形成为病理特征。该病与老化、遗传和环境因素密切相关，但其确切病因及发病机制未明。α突触核蛋白(α-synuclein，α-Syn)已被证明是Lewy体的主要成分，可能通过破坏多巴胺(DA)存储与释放、增加氧化应激等机制，在帕金森病中发挥重要的病理生理作用。从神经化学角度来看，与基底节功能有关的递质DA的减少，可能是帕金森病发生的一个重要环节。DA合成的主要调节因素是酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)，TH催化儿茶酚胺合成的第一步，即酪氨酸的羟化。大量研究显示，PD病人黑质纹状体内TH mRNA、TH蛋白及其活性明显降低。另外，近年发现在转染α-Syn的多巴胺能神经细胞系中，α-Syn的过表达显著地降低了TH的蛋白水平，在不影响细胞增殖的情况下抑制了TH的基因表达。但是，α-Syn抑制TH表达的分子机制尚不清楚。
经典理论认为，组蛋白在转录调控中发挥了关键作用。组蛋白乙酰化是一种重要的转录后修饰。组蛋白乙酰转移酶(histone acetylase，HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)共同调节乙酰化过程，从而改变染色质结构，进而调控基因表达。已有的研究表明，α-Syn可与组蛋白形成2∶1的复合体形式，并且观察到在神经细胞系中给予组蛋白去乙酰化酶的抑制剂(TrichostatinA，TSA)，可显著增高TH的启动子活性。本实验在本室以往研究基础上，探讨组蛋白去乙酰化酶在α-Syn抑制TH表达中的作用。主要研究方法与结果如下：
1.细胞培养及HDAC活性测定：MES23.5细胞、转染空载体(MES-vec)及转染α-Syn(MES-wt)的细胞生长到适当密度时(约1.5×107个细胞)，用NucBusterTM Protein Extraction Kit提取细胞核蛋白。BCA试剂盒进行核蛋白定量。各组细胞取相同量核提取物分别与HDAC活性检测试剂盒中的底物及发光剂孵育后，测其在405 nm的吸收值。MES23.5细胞(0.25±0.06)与MES-vec组(0.23±0.03)的吸收值无显著性的差异(p＞0.05，n=6)，而MES-wt组(0.44±0.09)HDAC的活性较MES-vec组显著增高(p＜0.01，n=6)。
2.TSA预处理及SRB法细胞活性测定：不同浓度(0，50ng/ml，100ng/ml，150ng/ml和200ng/ml)TSA作用于MES-wt细胞24h后，检测其核蛋白提取物的HDAC活性。100ng/ml的TSA可降低MES-wt细胞HDAC活性的60％，相当于降至MES-Vec组的HDAC水平。用三氯乙酸固定经100ng/ml TSA预处理的MES-wt细胞(MES-wt-TSA)及MES-wt细胞，SRB染色，再经乙酸清洗，Tris碱溶解，测其在490nm的吸光度。MES-wt组(0.19±0.04)与MES-wt-TSA组(0.18±0.04)细胞活性无显著差异(p＞0.05，n=6)。
3.SDS-PAGE电泳及免疫印记检测：提取各组细胞胞浆蛋白，用BCA法定量。等量样品进行12.5％SDS-PAGE电泳。随后通过电转的方式将聚丙烯酰胺胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。该膜先经牛奶封闭特异性抗原后，再先后与TH、β-actin单克隆抗体、二抗共孵育。最后经ECL反应和X胶片曝光得到相应的条带。MES23.5、MES-vec、MES-wt和MES-wt-TSA组TH的相对丰度为0.93±0.05、0.94±0.09、0.18±0.07、0.52±0.12。结果显示，转染α-Syn的细胞中TH蛋白表达显著降低(p＜0.01，n=6)，而在TSA作用于转染细胞24h后，显著上调了TH的表达(p＜0.01，n=6)，但并未达到转染空载体组的蛋白水平。
4. RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)检测：采用Trizol试剂分离各组细胞总RNA，用波长260nm的紫外光对RNA进行定量。mRNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板，用TH特异性引物进行PCR，同时选取管家基因GAPDH作为内参照物。各组TH及GAPDH的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。通过TH与GAPDH的电泳条带IOD比值进行半定量分析TH在mRNA水平上的差异。MES23.5组(0.53±0.09)与MES-vec组(0.52±0.09)TH mRNA表达无显著性差异(p＞0.05，n=6)，而MES-wt组(0.14±0.05)较MES-vec组显著降低(p＜0.01，n=6)，在经过TSA预处理的MES-wt-TSA组TH mRNA的表达水平(0.36±0.07)得到一定恢复，与MES-wt组相比具有统计学上的显著意义(p＜0.01，n=6)，但未恢复到MES-vec组水平。根据上述实验结果，我们得到如下结论：
1.α-Syn通过增加细胞核内组蛋白去乙酰化酶的活性，进而下调TH基因表达。
2.组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA在不影响细胞活性的情况下，从转录水平上调TH的表达，进而上调了TH的蛋白表达。
3. TSA上调TH的表达量并未增至MES-vec组水平，说明α-Syn尚通过其它途径抑制了TH的表达。
本实验在表观遗传学上为α突触核蛋白在帕金森病中的作用机制做出了解释，并提出了一种全新的酪氨酸羟化酶的调控模式。有可能为今后临床药物治疗帕金森病提供理论依据。