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背景与目的化疗及手术前后的新辅助化疗是食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）常用的治疗手段,但化疗耐药是影响治疗效果和患者预后的主要问题。因此,探究ESCC化疗耐药机制,寻找逆转ESCC化疗耐药方法是当前刻不容缓的事情。外泌体是细胞分泌的粒径在40-150 nm之间的细胞外囊泡,具有高稳定性、高特异性以及高灵敏性等特征。外泌体不仅能反映亲本细胞的生理病理状态,还参与了疾病的发生发展过程,如外泌体中的蛋白质、核酸和脂质等内容物能携带和传递重要的信号分子,在肿瘤化疗耐药中发挥重要的作用。为探究外泌体在ESCC紫杉醇耐药中的作用及其机制,我们进行了以下实验:1.验证ESCC耐药细胞外泌体可介导亲本细胞发生紫杉醇耐药。2.对亲本和耐药细胞外泌体进行LC-MS/MS蛋白组学分析,筛选并验证差异表达蛋白-铁蛋白重链1（ferritin heavy polypeptide 1,FTH1）。3.阐明耐药细胞外泌体中的FTH1在ESCC紫杉醇耐药中的作用及其机制。4.探究引起ESCC耐药细胞及其外泌体中FTH1高表达的可能机制。通过这些实验,为寻找ESCC紫杉醇耐药的分子标志物和逆转耐药的潜在治疗靶点提供理论依据。方法1 ESCC耐药细胞外泌体对亲本细胞耐药性的影响1.1透射电镜、纳米粒子跟踪仪以及Western blot实验分析外泌体表征。1.2 CCK8和Western blot实验检测外泌体对亲本细胞紫杉醇药物敏感性的影响。2差异表达蛋白的筛选及验证2.1对亲本和耐药细胞外泌体进行LC-MS/MS蛋白组学分析,筛选并验证差异表达蛋白。2.2 Western blot和免疫组化实验检测FTH1在ESCC细胞以及临床组织样本中的表达情况。3外泌体中的FTH1在ESCC紫杉醇耐药中的作用及其机制3.1将ESCC耐药细胞中FTH1表达下调或亲本细胞中FTH1表达上调,通过（1）Western blot、CCK8、Transwell和克隆形成实验检测FTH1对ESCC细胞耐药性、侵袭、迁移和克隆形成能力的影响;（2）Western blot实验检测细胞外泌体中FTH1表达水平变化。3.2 Western blot实验检测ESCC耐药细胞外泌体对亲本细胞中FTH1表达水平的影响;Western blot实验和流式细胞术检测ESCC耐药细胞外泌体对亲本细胞铁死亡的影响;CCK8实验检测外泌体中的FTH1对ESCC亲本细胞紫杉醇药物敏感性的影响。3.3 Western blot、流式细胞术和免疫组化实验检测细胞水平、动物模型以及临床样本中铁死亡情况。3.4 Western blot、流式细胞术和CCK8实验检测（1）FTH1对ESCC细胞铁死亡的影响;（2）erastin（铁死亡诱导剂）和Ferrostatin-1（铁死亡抑制剂）对ESCC细胞紫杉醇药物敏感性的影响。4引起ESCC紫杉醇耐药细胞及其外泌体中FTH1高表达的可能机制4.1 KEGG信号通路分析。Western blot实验检测亲本和耐药细胞中PI3K-AKT通路相关蛋白表达水平变化。4.2 Western blot实验检测FTH1表达水平变化对PI3K-AKT信号通路的影响。Western blot实验和流式细胞术检测LY294002（PI3K-AKT通路抑制剂）对ESCC耐药细胞中FTH1表达水平以及铁死亡的影响。Western blot实验检测LY294002对ESCC耐药细胞外泌体中FTH1表达水平的影响。结果1 ESCC耐药细胞外泌体可以介导亲本细胞紫杉醇耐药1.1透射电镜观察ESCC细胞外泌体呈现“茶托”形态,纳米粒子跟踪仪检测到外泌体粒径主要聚集在130 nm左右,Western blot实验在外泌体中检测到外泌体标志性蛋白CD63、CD81和TSG101。1.2 ESCC耐药细胞外泌体可显著增加亲本细胞耐药性（P＜0.05）。2差异表达蛋白的筛选及验证2.1筛选并验证在ESCC耐药细胞外泌体中显著高表达的蛋白-FTH1（P＜0.01）。2.2 FTH1的表达水平在（1）ESCC耐药细胞中显著高于亲本细胞（P＜0.01）;（2）ESCC患者肿瘤组织中显著高于癌旁组织;（3）ESCC淋巴转移患者肿瘤组织中显著高于非转移患者肿瘤组织。3外泌体中的FTH1在ESCC紫杉醇耐药中的作用及其机制3.1 ESCC耐药细胞中FTH1表达下调或亲本细胞中FTH1表达上调后,（1）细胞耐药性、侵袭、迁移和克隆形成能力显著降低或增加（P＜0.05）;（2）外泌体中FTH1表达水平显著降低或增加（P＜0.05）。耐药细胞外泌体中FTH1表达下调能显著降低对亲本细胞耐药性的影响（P＜0.01）。3.2 FTH1可以显著抑制ESCC细胞铁死亡（P＜0.05）。与亲本细胞相比,ESCC耐药细胞中铁死亡显著抑制（P＜0.05）。与非转移患者肿瘤组织相比,ESCC淋巴转移患者肿瘤组织中铁死亡显著抑制。3.3 erastin可显著增加ESCC耐药细胞紫杉醇药物敏感性,而Ferrostatin-1可显著降低ESCC细胞紫杉醇药物敏感性（P＜0.05）。4 PI3K-AKT信号通路可能参与调控耐药细胞中FTH1的表达4.1与亲本细胞相比,耐药细胞中PI3K-AKT信号通路异常激活。4.2改变细胞中FTH1表达水平,PI3K-AKT信号通路相关蛋白表达水平无显著性差异。然而,LY294002作用于耐药细胞后可显著降低细胞中FTH1的表达水平以及促进细胞铁死亡的发生,其分泌的外泌体中FTH1表达水平也显著降低（P＜0.05）。结论1 ESCC耐药细胞中PI3K-AKT信号通路异常激活可能上调FTH1的表达水平,高表达的FTH1可以通过外泌体传递至亲本细胞。2耐药细胞外泌体中的FTH1可以通过抑制铁死亡介导ESCC细胞紫杉醇耐药。