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一、目的本实验采用脂多糖(LPS)刺激体外培养的人气道上皮细胞建立气道上皮炎症反应模型,检测连环素p120(简称p120)蛋白的表达变化、NF-kB信号通路的活化及其下游靶基因IL-8的表达变化,初步探讨人体气道炎症发生的分子机制。二、方法根据MTT结果及本实验室前期研究,选取20μg/ml LPS作为致炎因子处理培养的人气道上皮细胞；运用免疫荧光、细胞核浆分离提取蛋白及Western blot技术检测刺激前后p120、抑制蛋白IkBa及NF-kB亚基p65蛋白表达的改变及p65是否发生核内转位；运用ELISA和荧光实时定量PCR技术分别检测IL-8表达量的改变；运用瞬时转染及特异性siRNA技术以增强或敲低细胞中p120的表达,进一步验证p120与NF-kB信号通路之间的关系。三、结果Ⅰ.Western blot、荧光实时定量PCR及免疫荧光染色证实p120存在于人气道上皮细胞中,而且,与对照组比较,LPS刺激后p120蛋白表达下调。Ⅱ.细胞核浆分离提蛋白及Western blot技术检测发现LPS刺激人气道上皮细胞后,NF-κB信号通路活化——NF-κB p65总蛋白表达增多,而且转位入核,其抑制蛋白IκBα表达逐渐减少。同时,荧光实时定量PCR和ELISA显示NF-κB下游的靶基因IL-8的表达量较未给予LPS刺激的对照组明显增多,差异具有显著性。Ⅲ.外源性高表达p120及siRNA技术使细胞中p120低表达后,进一步验证p120与NF-kB信号通路之间的关系。实验结果表明,外源性p120过表达后,NF-kB p65总蛋白量几乎无改变,p65未发生核转位,IL-8的表达水平变化不大。然而,LPS刺激后,过表达组IL-8表达较对照组明显降低(P<0.001)。p120敲低后NF-kB信号通路显著活化——NF-kB p65总蛋白表达增多,p65转位入核,IL-8表达水平增加(P<0.001)。进一步证明LPS诱导的气道炎症反应中,p120可能通过负性调控NF-kB信号通路抑制炎症反应。四、结论LPS诱导的气道炎症反应中,p120蛋白表达下调,NF-kB信号通路活化；过表达p120可抑制NF-kB信号通路,敲低p120后NF-kB信号通路显著活化。我们推测,LPS刺激可能通过下调p120进而活化NF-kB信号通路引起气道上皮的炎症反应。一、目的本实验通过LPS刺激及机械划伤建立体外培养的人气道上皮细胞炎症反应模型,检测RhoGTP酶家族蛋白RhoA活性变化及其与p120、NF-kB之间的关系,探讨气道炎症中p120调控NF-kB信号通路活化的可能分子机制。二、方法运用免疫共沉淀及Western blot方法检测刺激前后RhoA总蛋白表达改变及其与p120的结合情况：运用G-LISA方法检测RhoA活性变化；采用RhoA下游ROCK抑制剂Y26732抑制RhoA活性后,通过细胞核浆分离提取蛋白及Western blot检测NF-kB的活性变化；使用瞬时转染外源性p120质粒及特异性siRNA技术干预p120表达,进一步观测气道上皮细胞中RhoA活性变化及其与p120、NF-κB之间的关系。三、结果Ⅰ.免疫共沉淀结果首次显示气道上皮细胞中RhoA与p120相互作用并存在于同一复合物中。II.LPS刺激和机械划伤方法处理气道上皮细胞后,Western blot及免疫共沉淀结果显示RhoA总蛋白以及与p120结合的RhoA蛋白改变不明显,但G-LISA检测发现RhoA活性显著上升。Ⅲ.运用抑制剂Y27632抑制RhoA活性后,细胞核浆分离提取蛋白及Western blot结果显示气道炎症反应中NF-kB p65亚基的入核被部分抑制。Ⅳ.p120过表达后,与对照组相比,尽管RhoA活性无变化,但LPS刺激后,p120过表达组RhoA活性明显下降(P<0.001)；同样,机械划伤刺激后,p120AN过表达组RhoA活性明显下降(P<0.05),同时,IL-8表达下调。V.siRNA敲低p120后,RhoA总蛋白无变化,与p120结合的RhoA随着p120表达缺失而无法检测。G-LISA检测发现RhoA活性显著上升,LPS刺激和机械划伤后,RhoA活性升高更为显著(P<0.001及P<0.05)。同时,机械划伤后IL-8表达增加,差异具有显著性。四、结论Ⅰ.气道上皮细胞中,RhoA与p120存在于同一复合物中。气道炎症反应中,虽然RhoA总蛋白以及和p120结合的RhoA蛋白无变化,但RhoA活化。Ⅱ.抑制剂Y27632抑制RhoA活性后,NF-kB活化被部分抑制。Ⅲ.p120过表达不活化RhoA,但p120敲低后RhoA活性显著上升,伴随NF-kB p65亚基转位入核及IL-8表达水平增加。我们推测,气道炎症反应中p120可能部分通过RhoA实现对NF-kB信号通路的调控。