纳豆是日本的一种传统发酵豆制品,距今已有一千多年的历史。纳豆激酶（Nattokinase）属于碱性丝氨酸蛋白酶的一种,是大豆在发酵过程中由纳豆枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto）产生的一种具有强烈纤溶作用的丝氨酸蛋白酶,具有溶解血栓的功能,被认为是新一代溶栓药物。美国自然科学协会对纳豆激酶的安全性进行了评估,证实纳豆激酶可被作为新型溶栓药物进行临床研究。然而,在工业生产中,这种蛋白酶对温度、酸碱等外部条件很敏感,导致其在实现高表达的同时,面临高温加热会造成纳豆激酶的活性大幅损失的问题。因此,如何在高温环境中保留并提高纳豆激酶的活性是当前的研究热点。现如今,借助模拟计算改造酶的性质已是趋势。本论文旨在通过计算软件精准定位纳豆激酶的突变位点、构建突变体纳豆激酶重组表达系统,获得目的蛋白,提高其耐热性。本研究首先使用ABACUS和Rosetta＿ddg蛋白模拟软件,筛选得到大批量纳豆激酶突变位点,通过分子动力学模拟衡量突变位点的稳定性,最终筛选出六个稳定性较高的突变位点:T71L、S89V、E156F、E195W、Q206L、Y256P。选择PGEX-6P-1作为原核表达载体,构建了含有野生型纳豆激酶的重组质粒PGEX-6P-NK,以此重组质粒为模板,通过重叠延伸PCR法分别构建六个含有突变位点的突变体纳豆激酶。经过测序验证突变成功后,将其分别转化进BL21大肠杆菌表达载体中。通过诱导菌株表达蛋白,收集菌体,细胞破碎,得到了野生型和突变体纳豆激酶上清液和沉淀。经过纤维蛋白平板法验证突变体纳豆激酶E156F、Q206L、Y256P均具有溶栓活性。将有活性的突变体和野生型纳豆激酶通过GST标签蛋白纯化柱进行蛋白纯化,获得含有目的蛋白的单一条带,并通过SDS-PAGE验证。采用紫外分光光度计法测量野生型和突变体的酶活:经测量,在37℃条件下,野生型纳豆激酶活性达到89.26FU/m L;其中,突变体Y256P的酶活与野生型相比提高了51.83%,其酶活达到135.53 FU/m L;突变体E156F的酶活与野生型相比提高了5.46%,其酶活达到了94.13 FU/m L;突变体Q206L的酶活与野生型相比降低了21.73%,酶活达到了69.86 FU/m L。为了验证上述三个突变体的耐热性,在65℃下处理30 min后测量酶活,结果显示野生型热损失率为84.24%,Q206L损失较小,热损失率为21.4%。为了验证最高耐热温度,在不同温度下孵育30 min后,结果表明:耐热性最高的是Y256P达到70℃,比野生型提高了5℃。E156F和Q206L的耐热性与野生型相比也有提高,最高耐热温度为69℃。因此,本研究成功筛选并构建了酶活性与耐热性均有提高的纳豆激酶突变体E156F和Y256P。突变体Q206L经改造后虽然酶活没有得到提高,但是耐热性与野生型纳豆激酶相比有显著提高。综上所述,以上研究成果弥补了纳豆激酶在工业化生产中不耐高温、活性过低的缺陷,为进一步批量生产新型纳豆激酶药物提供了坚实的基础。