研究背景　　 肺癌是世界范围内引起死亡的重要疾病,早期诊断对于肺癌的防治具有重要意义。目前肺癌筛查的方法有X—ray、螺旋CT(Spiral Computed Tomography)、支气管镜(Bronchoscopy)、痰液细胞学(Cytology)检查、痰液或血液的基因突变检测以及最近几年发展起来的基因甲基化检测,每种方法都有优势和不足之处,对外周血或痰液中的DNA进行甲基化分析是更有应用前景的肺癌筛查方法。　　 在毒理学领域,已经证明表观遗传学改变特别是特定基因启动子区高甲基化引起的基因沉默是癌症发生的早期事件,多种化学物可以引起基因的异常甲基化[1-3],检测生物样本中特定基因的甲基化水平有助于肿瘤的早期诊断。　　 化学致癌物的判定是一项艰巨、耗时和复杂的工作,其中试验检测方法包括致突变试验、细胞恶性转化试验和哺乳动物致癌试验(短期、长期)。致突变试验不能发现非遗传毒性致癌物,动物致癌试验花费大、周期长,难以应付实际需要；此外,许多啮齿类动物致癌物对人类并没有致癌作用,反之也是如此。同时,化学物毒性评价中的“3R原则”(Reduction,减少试验动物数量；Refinement,减轻试验动物的痛苦；Replacement,替代动物试验)被越来越多的机构认可,动物试验逐渐不再作为试验阶段的“金标准”。细胞恶性转化试验是理想的短期致癌性检测试验,它以细胞获得裸鼠体内致瘤能力作为恶性转化的观察终点。　　 虽然机制并不明确,但基因启动子区高甲基化导致基因沉默提供了除基因突变之外的第二条抑癌基因失活途径,相对于基因突变位点的不确定性,甲基化改变主要集中在基因启动子区的CpG岛。甲基化特异性PCR可以快速、灵敏检测CpG岛甲基化状态,大大促进了甲基化基因作为肿瘤biomarker的研究。这些研究虽然提供了有用的线索,但缺乏从细胞到人群流行病学研究相一致的证据。　　 研究目标　　 1.评价细胞体外转化模型在致癌物筛查中的价值；　　 2.发现与肺癌相关的新的生物标志物。　　 研究内容　　 1.建立B(a)P诱导永生化人支气管上皮细胞体外转化模型　　 原代培养的人支气管上皮在导入SV40LT和Ras后,成为处于转化前状态的永生化细胞,经致癌物B(a)P进行短期诱导即发生恶性转化,细胞转化模型的建立是研究细胞转化机制的基础。　　 2.细胞转化过程中差异甲基化基因的筛选　　 利用MeDIP和芯片技术筛选细胞转化过程中甲基化状态发生规律变化的基因,为后续biomarker的研究提供线索。　　 3.启动子区高甲基化与基因沉默关系的研究　　 研究细胞转化过程中、特定基因甲基化、基因表达及细胞生物学性状之间的逻辑关系,获取基因甲基化参与细胞转化的试验证据。　　 4.靶基因在肺癌标本中的甲基化状态及表达情况　　 研究细胞水平基因甲基化改变的证据与人群标本的一致性,分析差异的原因,判断细胞模型的应用价值。　　 主要方法　　 1.细胞株选择和构建　　 HBE细胞是表达SV40LT的人支气管上皮细胞,HBE细胞有稳定的染色体数目,统一的大小和形态,具有接触抑制的表型,裸鼠皮下注射不能形成肿瘤。本实验室在HBE细胞的基础上分别导入稳定表达的H-Ras基因,构建了HBER细胞株,HBER的生长速度是HBE的2.4倍,HBER不能在软琼脂上生长,不能在裸鼠皮下形成肿瘤,但毒物诱导HBER转化的时间比HBE大大缩短。　　 2.芯片分析　　 采用甲基化DNA免疫沉淀的方法(MeDIP)免疫捕获基因组中甲基化的DNA片段；免疫沉淀富集的DNA通过Nimblegen公司的DNA Methylation CpGIsland—Plus-Promoter Tiling Array检测；芯片数据结果采用SignalMap软件进行分析,差异甲基化的基因应用Passway Studio5.0软件作进一步的功能分类。　　 3.亚硫酸氢盐修饰测序　　 取2μgDNA,变性后加入5M的亚硫酸氢盐处理液,55℃下12-16小时,基因组中未甲基化的的胞嘧啶转变为尿嘧啶,甲基化的胞嘧啶保持不变。使用Wizard DNA clean-up system(Promega,Madison,WI)脱盐、脱磺基、纯化DNA。PCR扩增亚硫酸氢盐修饰后的DNA,凝胶回收PCR产物,浓缩后插入pMD19-T载体,连接产物加入感受态大肠杆菌JM109,转化菌均匀涂在氨苄选择平板上,筛选阳性克隆,PCR鉴定重组质粒,挑选阳性克隆,提取质粒,上机测序。　　 4.甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)　　 基因组DNA提取、亚硫酸氢盐修饰及脱盐、纯化DNA同3。在基因启动子区甲基化热点区域,分别针对甲基化DNA和未甲基化DNA设计两对引物,引物序列上含有2～3个CpG位点,PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳。　　 主要结果　　 20μM B(a)P染毒HBER细胞从第11周开始有明显的克隆生长,于14周和17周达到26.38％和27.50％。芯片检测738个基因在转化后细胞HBERT中呈现甲基化状态,其中128个基因在转化中呈现持续甲基化状态(Unchanged pattern,17％),149个基因在染毒前和转化后呈甲基化状态,而在转化前细胞中呈非甲基化状态(Contrary pattern,20％),378个基因仅在转化后细胞中呈现甲基化状态(Transformation-specific pattern,51％),83个基因在染毒前呈非甲基化状态而在转化前和转化后呈甲基化状态(Early pattern,11％)。83个“基因”中有8个为非编码序列,运用RT-PCR检测余下75个基因在HBER、HBERNT和HBERT细胞中的表达水平,6个在细胞中检测不到mRNA,52个在转化过程中没有发生变化或变化没有规律,17个在转化前和转化后细胞中有显著的下降。运用亚硫酸氢盐修饰后测序的方法检测17个基因启动子区甲基化状态,测序范围涵盖芯片中阳性探针所在的位点,结果显示,有7个基因在在HBER细胞中呈现未甲基化而在HBERNT和HBERT细胞中呈现高甲基化状态。这7个基因作为潜在的受甲基化调控的抑癌基因,是后续研究的靶点。亚硫酸氢盐修饰后测序法验证CNGA4在HBER细胞中呈现部分甲基化,而在HBERNT和HBERT中甲基化水平升高。在肺癌细胞株H226、SKME-1和A549中也呈现高甲基化状态。去甲基化药物5-杂氮胞苷(5-AZA)可显著回复HBERNT和HBERT细胞以及肺癌细胞株SKME-1中CNGA4mRNA水平。收集10对肺癌组织和相邻的癌旁组织,用亚硫酸氢盐修饰后测序技术检测CNGA4启动子区甲基化水平,同时用RT-PCR方法检测mRNA表达水平,结果显示癌组织中CNGA4呈现高甲基化,同时mRNA表达下降。用RNA干扰技术在HBE细胞基础上构建CNGA4低表达细胞株,相对于对照细胞,低表达并不影响细胞生长速度。但在20μM B(a)P作用下,缺陷细胞株的DNA损伤程度加剧,表现为彗星试验中尾距增加43％,双核微核试验中双核微核数目增加25％。　　 结论　　 1.CNGA4基因甲基化与B(a)P诱导的细胞转化相关；　　 2.基于CNGA4调控DNA损伤修复以及在肿瘤组织的高甲基化,CNGA4高甲基化可作为化学致癌的特异性标志物应用于环境或职业暴露的生物监测。