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传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)是引起鸡和火鸡的一种急性、热性、高度接触性传染病的病原。VP2是宿主的主要保护性抗原,它与IBDV的毒力强弱、抗原变异及病毒中和性抗体的诱导和识别有关。利用各种表达载体表达VP2用于制备基因工程疫苗是目前传染性法氏囊病预防与控制研究的主要方向。杆状病毒表达载体系统(Baculovirus Expression Vector System,BEVS)是一个以杆状病毒为外源基因载体,以昆虫细胞为受体的表达系统,它具有安全、高效、容量大、重组病毒易于筛选、表达产物能进行折叠和修饰且具有生物活性等特点。表位附加标记(epitope tag),就是将附加的抗原表位融合到目的蛋白以检测目的蛋白的表达,同时还可以通过亲和层析法来纯化目的蛋白及利用免疫荧光技术对标记蛋白进行亚细胞定位。HA-TAG是目前使用比较广泛的表位附加标记。本课题将HA-TAG与IBDV-VP2利用Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统在CHO细胞系中进行融合蛋白表达,比较分析不同重组载体对蛋白表达水平的影响,择优表达体系,为禽类基因工程疫苗的研制提供新的思路。以GenBank上已发表的IBDV-VP2序列为参考序列,应用DNAstar软件设计一对特异性引物,将HA-TAG基因序列融合于IBDV-VP2基因的5’端,通过PCR方法,扩增HA-VP2基因,并将其克隆到pMD18-T载体上,经限制性内切酶分析以及核苷酸序列测定,证明获得了含有HA-VP2融合基因的阳性重组质粒pTZF-HA-VP2。再将HA-VP2基因亚克隆至先前构建好的转移载体pWK、pWK-I、pLM、pLM-I、pSD、pSD-I、pWKC、pLMC、pSDC中,经不同的酶组合后酶切鉴定,证明了获得含有不同表达盒及调控元件的重组转移载体pTZF-WK-HA-VP2、pTZF-WK-I-HA-VP2、pTZF-LM-HA-VP2、pTZF-LM-I-HA-VP2、pTZF-SD-HA-VP2、pTZF-SD-I-HA-VP2、pTZF-WKC-HA-VP2、pTZF-LMC-HA-VP2、pTZF-SDC-HA-VP2,将这些转移载体分别转化至E.coliDH10Bac感受态细胞中,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统生成重组穿梭质粒rBac-TZF-WK-HA-VP2、rBac-TZF-WK-I-HA-VP2、rBac-TZF-SD-HA-VP2、rBac-TZF-SD-I-HA-VP2、rBac-TZF-LM-HA-VP2、rBac-TZF-LM-I-HA-VP2、rBac-TZF-WKC-HA-VP2、rBac-TZF-SDC-HA-VP2、rBac-TZF-LMC-HA-VP2,转染sf9昆虫细胞后,获得重组杆状病毒P1代储备,继续扩增病毒至P3代,空斑法分析病毒的滴度均在1-2×108pfu／mL左右。最后,将获得的9个重组杆状病毒同时侵染中国仓鼠卵巢细胞(CHO),利用SDS-PAGE和Western-blotting成功检测到HA-VP2蛋白的表达。研究结果表明,优化后的杆状病毒表达载体系统能够较好地表达具有抗原性的传染性法氏囊病病毒VP2抗原蛋白,为探究改进型重组杆状病毒作为基因传递的载体研制禽类基因工程疫苗奠定了坚实的基础。