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背景:鞭毛/纤毛是细胞表面的突起物,在生物进化的过程中逐渐成为专门的细胞器,在细胞的运动、感知外界环境变化及信号向细胞内的传递过程中担任重要角色,纤毛的异常会导致多囊肾疾病、肥胖症、糖尿病、癌症等人类疾病。
鞭毛内运输(IFT)是一种沿着微管轴丝的双向运动过程,对于绝大多数真核生物的鞭毛/纤毛的形成和维持是至关重要的,这个复杂的过程受到细胞内外各种因素的影响。驱动蛋白2是驱动蛋白家族中的一个成员,是鞭毛/纤毛内负责正向运输的关键马达蛋白。驱动蛋白2是一个异源三聚体,包括同源性较高的FLA8和FLA10亚基以及一个KAP亚基。其中FLA8和FLA10均由马达(motor)头部和螺旋一卷曲一螺旋的尾部组成,这两个亚基的尾部相互缠绕形成棒状结构,它们头部的马达则利用水解ATP产生能量沿着微管以类似行走(walking)的方式向微管正末端运动。
杜氏盐藻(Dunaliella salina)是一种单细胞绿藻,有一对等长的鞭毛,培养条件简单。由于其具有1对等长的鞭毛而可以被用作研究鞭毛内运输及鞭毛相关疾病的模式生物。
目的:探究驱动蛋白2亚基FLA8在鞭毛内运输中的调控机制,筛选杜氏盐藻中能与FLA8相互作用的新蛋白,扩增所捕获的蛋白FAP107的cDNA全长并对其进行原核表达,检测FAP107在杜氏盐藻鞭毛再生过程中的表达情况。
方法:本实验用酵母双杂交的方法,以杜氏盐藻驱动蛋白2亚基FLA8-C端(FLA8-C)为诱饵筛选杜氏盐藻cDNA表达文库,经营养缺陷型培养及α-半乳糖苷酶活性检测,筛选与FLA8-C端相互作用的蛋白质。用5RACE的方法扩增得到FAP107cDNA的5’端序列,与原已知序列拼接得到其cDNA全长:构建FAP107原核表达载体,用IPTG诱导对该蛋白质进行原核表达。用酵母共转化的方法对FLA8与FAP107之间的相互作用进行验证。以GAPDH作为内参,用实时荧光定量PCR的方法探索杜氏盐藻FAP107在鞭毛再生过程中的表达量变化情况,结果用2-△△CT法分析。
结果:酵母双杂交筛选得到的阳性克隆中所含的蛋白包括鞭毛相关蛋白107(FAP107)C端、蛋白质.蛋白质结合结构域(PDZ)、含P环的核苷三磷酸水解酶(P-loop NTPase)结构域以及微管辅助蛋白B的富含甘氨酸的细胞骨架结合蛋白结构域(CAP-Gly结构域)。扩增得到了FAP107 cDNA的全长,共1207bp,其中5’UTR长133 bp,3’UTR长354bp,编码区长720 bp,编码239个氨基酸,该氨基酸序列与莱茵衣藻和团藻同源性为44％。该cDNA序列及氨基酸序列已提交GenBank,序列号为JN835298.1。成功的对FAP107进行了原核表达,SDS-PAGE检测HIS-FAP107融合蛋白其大小约为30 kD,与预测值一致。在杜氏盐藻鞭毛再生过程中FAP107 mRNA表达水平明显高于正常未处理条件下的杜氏盐藻FAP107基因的相对表达量(Fgroup=344.550,P＜0.001;Ftime=63.574,P＜0.001;Fiateraction=54.511,P＜0.001),其变化趋势为:在0-60 min内FAP107mRNA水平逐渐降低,在60 min时表达量达到最小;60-210 min内FAP107mRNA水平呈不断升高的趋势,至210min时达到最大值:210-330 min内FAP107mRNA水平又逐渐降低,并在300 min左右降至正常水平。
结论:成功用酵母双杂交的方法筛选得到与FLA8相互作用的新蛋白FAP107,该蛋白可能参与了鞭毛伸长。