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检测不同转移度的大肠癌病理蜡块和新鲜组织标本中RAB5A和CD44v9基因和蛋白质的表达情况及相关性;应用FAM标记的RAB5A和CD44v9正义与反义寡核苷酸,体外转染高、低转移度的大肠癌细胞,观察肿瘤细胞的生长及转移相关功能与指标的变化;同时观察其对裸鼠移植瘤模型的抑瘤作用及抑制肿瘤转移的效果,以初步探讨RAB5A和CD44v9在大肠癌转移中的作用与机制。
方法:1.应用S-P免疫组化法检测并分析不同转移度大肠癌的石蜡包埋组织中CD44v9和RAB5A蛋白的表达情况;Trizol法提取大肠癌新鲜组织RNA、逆转录合成cDNA第一链,应用实时荧光定量PCR法检测其RAB5A和CD44v9mRNA的表达量,分析RAB5A和CD44v9基因与蛋白质表达与大肠癌转移程度的相关性。
2.用脂质体分别将RAB5A和CD44v9的正义和反义寡核苷酸转染人大肠癌高转移细胞LS174T和低转移细胞HT29,细胞增殖抑制实验(MTT法)检测RAB5A和CD44v9对细胞的生长和增殖的影响;同时用transwell小室法检测二者对细胞的粘附、侵袭和运动能力的影响,并明胶酶谱法检测细胞金属基质蛋白酶MMP2的分泌与活性的变化;RT-PCR法检测不同转移度大肠癌细胞的RAB5A和CD44v9的mRNA表达相关性。
3.建立人大肠癌高转移和低转移的裸鼠模型,分组给予RAB5A和CD44v9反义寡核苷酸治疗,观察荷瘤鼠的体积、肿瘤大小以计算抑瘤率;RT-PCR和免疫组化法检测治疗组CD44v9和RAB5A的表达;病理切片观察各器官的肿瘤转移情况。
结果:1.免疫组化检测可见43例高低不同分化程度的大肠癌组织中,RAB5A蛋白均有不同程度的表达,阳性率达100%(43/43)。其中,高分化的12例中只有3例强阳性,而低分化的31例中28例强阳性,阳性表达位于胞质和胞膜。35例有不同程度的CD44v9表达,阳性率为81.4%(35/43),阳性表达主要位于胞质和胞膜。定量PCR结果可见经熔解曲线分析各样本扩增产物的Tm值一致并与阳性对照的Tm值吻合。其中,RAB5AcDNA的表达量在高分化和中分化大肠癌组织中要低于低分化大肠癌组织(p<0.05),显著低于大肠癌粘液腺癌组织(p<0.01)。而CD44v9cDNA的表达趋势与RAB5A相同。
2.转染24h后即可见明显的荧光表达;MTT实验可见RAB5A反义寡核苷酸能抑制大肠癌高转移和低转移细胞的增殖,而CD44v9反义寡核苷酸无此作用;transwell小室法可见RAB5A和CD44v9反义寡核苷酸均能抑制高转移大肠癌细胞的粘附、浸润和运动能力,同时提高低转移细胞的粘附、浸润和运动能力;明胶酶谱法见RAB5A和CD44v9反义寡核苷酸均能抑制基质金属蛋白酶的分泌和活性。RT-PCR结果可见RAB5A和CD44v9的基因表达具有相关性。
3.裸鼠实验见,在大肠癌高转移和低转移组中RAB5A和CD44v9反义寡核苷酸均具有抑瘤效果(均p<0.05)。反义寡核苷酸组的肿瘤组织中RAB5A和CD44v9基因和蛋白质表达均减少,金属基质蛋白酶分泌亦减少且活性降低,远隔脏器无转移发生。而正义寡核苷酸组以上指标均与模型组无差别(p>0.05)。
结论:实验结果证明了RAB5A在大肠癌中表达,其表达强度与大肠癌的分化程度及转移度相关,且RAB5A与CD44v9的表达水平正相关;在体内外抑制RAB5A的表达可抑制大肠癌的转移;RAB5A反义核苷酸治疗在体内外均有疗效,可作为一种大肠癌有效的治疗手段做以进一步研究。