论文部分内容阅读
目的受激活调节正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)是趋化因子超家族成员,该分子生物学功能复杂多样。有报道发现RANTES存在于正常成人的精液中,但其组织细胞来源尚不清楚。本实验目的在于系统地研究RANTES在男性生殖系统内的表达及意义。方法1.利用聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质免疫印迹杂交(Western blot)、原位杂交、免疫组织化学及免疫荧光等方法,观察RANTES及其受体在成年男性生殖系统内的表达和分布情况。2.根据上述实验结果,利用RT-PCR、实时定量RT-PCR,Western blot及免疫组织化学等方法,观察RANTES在小鼠附睾内的表达分布。利用Western blot检测在小鼠发育不同阶段(7、14、21、28、35、42、49、56和140天)RANTES表达水平的变化。3.分离纯化小鼠附睾各段精子,利用免疫荧光、流式细胞术等方法确定RANTES结合精子的部位及结合量。结果1.RT-PCR结果显示RANTES mRNA在人前列腺和附睾有表达,但在睾丸和精子未见表达。Western blot检测到RANTES蛋白在人附睾头部及尾部有高表达,在体部表达相对较低。原位杂交与免疫组化结果提示,表达RANTES的细胞为输出小管的纤毛细胞、附睾管的狭窄细胞、顶细胞和基细胞。免疫荧光双标实验利用特异性细胞标记物,进一步证实了RANTES在附睾上皮的细胞定位。此外,RANTES受体CCR1和CCR5 mRNA在附睾均有表达,原位杂交及免疫组织化学实验表明CCR5受体在附睾上皮广泛表达。2. RT-PCR结果提示RANTES mRNA在小鼠附睾都有表达,免疫组织化学实验证明RANTES表达于小鼠输出小管的纤毛细胞、附睾管的狭窄细胞和顶细胞。实时定量PCR和Western blot证明RANTES表达量在小鼠附睾头部最高,体部较少,尾部几乎检测不到。Western blot显示RANTES在小鼠出生后第28天开始出现,35天表达迅速升高,之后表达量逐步升高,直至出生后140天,RANTES在附睾的表达仍然保持较高水平。3.间接免疫荧光显示RANTES结合于附睾正常精子的尾部中段,异常精子的头部和尾部中段。流式细胞术显示,随着精子在附睾内的转运,RANTES与精子的结合率逐渐降低。结论1. RANTES表达于人输出小管与附睾管的上皮细胞,可能参与附睾管腔内微环境的调节。2. RANTES在小鼠发育过程中的变化提示,RANTES可能参与精子成熟的过程的调节。3. RANTES在人和小鼠附睾管腔内与正常精子的结合提示,RANTES可能在受精前过程中发挥作用。与异常精子的结合提示,RANTES可能调节异常精子的免疫原性,促进其被上皮细胞吞噬,对维持附睾内的微环境稳定发挥作用。