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消化道肿瘤约占恶性肿瘤的60～70%。胃肠道癌占消化道恶性肿瘤的绝大部分,是常见的恶性肿瘤。转移,特别是血行转移,是恶性肿瘤最特征的生物行为,也是胃肠道癌患者死亡的最主要原因。常规临床检查发现转移灶的患者多已较晚,治疗效果差。检测胃肠道癌患者外周血中微转移,对于早期发现和诊断肿瘤转移,判断预后和指导治疗,提高防治效果有重要的意义。 本研究应用巢式逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)方法检测细胞角蛋白19(CK19)mRNA与细胞角蛋白20(CK20)mRNA以及CK19mRNA或与CK20mRNA的表达,负性免疫磁珠分离(immunomagnetic separation,IMS)结合巢式RT—PCR的方法检测CK19mRNA与CK20mRNA以及CK19mRNA或与CK20mRNA的表达,与负性IMS结合免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)的方法检测BerEP4的表达等方法检测临床常规检查无转移的胃肠道癌患者手术前外周血中的微转移的情况,对比分析其检测结果及检测结果与手术后临床病理分期的关系,研究这些方法检测外周血微转移的价值和意义,为临床提供可靠的检测外周血微转移和监测与早期发现转移的方法。沁声,次才2()05浙江大学硕士论文材料与方法 分别任意选取2004年3月至8月间32例手术前临床检查无转移的胃肠道癌患者,12例胃肠道良性疾病患者和13例体检健康者,为巢式R了’- PCR法检测外周血CK19mRNA与CK20mRNA以及CK19或与CK20mRNA表达的研究对象。2004年3月至2005年3月间巧例手术前临床检查无转移的胃肠道癌患者,为ICC法检测外周血BerEP4的研究对象。采用巢式RT-PCR法检测手术前胃肠道癌患者与胃肠道良性疾病患者和体检健康者外周血CK19mRNA与CK20mRNA以及CK19或与CK20mRNA的表达,采用负性IMS结合巢式Rl仁PCR法对比检测32例手术前胃肠道癌患者外周血CK19mRNA与CK20mRNA以及CK19或与CK20mRNA的表达,采用负性IMS结合ICC法检测巧例手术前胃肠道癌患者外周血BerEP4的表达。分别分析检查结果及检测结果与手术后病理分期的相关性,对比分析常规未用负性IMS和应用负性 IMS检测外周血CK19mRNA与CK20mRNA以及CK19或与CKZOmRNA的表达阳性率及其与手术后病理分期的相关性。结果 1.巢式RT-PcR法检测cK19mRNA与cK20m胭A的灵敏度均为10一“。胃肠道癌患者外周血CK19mRNA与CKZOmRNA以及CK19或与CKZOmRNA的表达阳性率分别为28%、34%和50%,而良性胃肠道疾病和健康人表达均为阴性,CK 1 gmRNA或与CKZOmRNA的表达阳性率高于CK19mRNA与CK20mRNA的表达阳性率;CK19mRNA与CK20mRNA以及CK19mRNA或与CKZOmRNA的表达阳性者的手术后为一11一xv期患者比例分别为780;0(7/9)、82%(9/11)与75%(12八6),都高于相应的表达阴性者的川一xv期患者比例520,0。2/23)、48%(10/21)与44%(7/16)。111一IV期的胃肠道癌患者CK19mRNA与CK20mRNA以及eK19或与CK20mRNA的表达阳性率分别为37%(7/19)、47%(9/19)与63%(12/19),_加声,认掌一勿一分别高于相应的一11期患者的阳性率一5%(2/x3)、15%(2/]3)与3]%(4/13),但无统计学差异。2.负性IMS吸附效率为71一82%(除去外周血中血细胞比例)。负性IMS结合巢式RT一PCR法检测胃肠道癌患者外周血CK19mRNA与CK20mRNA以及CK19mRNA或与CK20mRNA的表达阳性率分别为47%、56%与81%,比未应用负性IMS的阳性率都有明显提高,其中CK19mRNA或与CKZOmRNA的表达阳性率提高有统计学意义(尸<0.05)。CK19mRNA与CK20mRNA以及CK19mRNA或与CK20mRNA的表达阳性者的手术后为m一IV期患者比例分别为80%(12门5)、72%(13/18)与69%(18/26),都分别高于表达阴性者的111一IV期患者比例引%(7/17)、43%(6/14)与17%(1/6);111~IV期的胃肠道癌患者CK19mRNA与CK20mRNA以及CK19或与CK20mRNA的表达阳性率分别为63%(12/19)、68%(13/19)与95%(18/19),分别高于相应的I~11期患者的阳性率23%(3/13)、38%(5/13)与62%(8/13),其中负性IMS结合巢式Rl飞PCR法检测CK19mRNA的表达阳性率分别为63%、23%,差异显著(尸<0.05);负性IMS结合巢式RT-PCR法检测CK19mRNA或与CKZOmRNA表达阳性率分别为95%、62%,差异显著(尸<0.05)。3.负性IMS结合ICC法检测胃肠道癌外周血BerEP4的表达阳性率为33%,未应用负性IMS的ICC法检测未能检测到阳性表达,差别有统计学意义(尸<0.05);表达阳性者的手术后为m一W期患者比例为80%(4/5),高于表达阴性者的111~IV期患者比例60%(6/10);111一IV期的胃肠道癌患者BerEP4表达阳性率为40%(4/10),高于相应的I一H期患者的阳性率20%(l巧)。结论 1.巢式RT-PCR法检测CK19mRNA与CK20mRNA以及CK1920mRNA或与CK20mRNA的表达都可作为检测胃肠道癌外周血微转移方法,其中联合检测CK1920mRNA或与CK20mRNA表达的敏感性较高。2.负性IMS可除去大部分血细胞,实现对肿瘤细胞的高效富集,提高阳性检出率。负性IMs结合巢式RT-PCR