禽流感(AvianInfluenza)是由A型流感病毒引起的一种禽类(家禽和野禽)的感染和或疾病综合症。目前，我国主要是用AIV灭活苗对家禽进行免疫来防控禽流感，但这给禽流感的监控带来了困难，因此，建立一种鉴别诊断禽流感人工免疫群与自然感染群的方法已成为当务之急。 本研究采用RT-PCR方法扩增并克隆了两株H5N1亚型AIV国内分离株的NS1基因。序列分析表明，它们分属于NS等位基因群的A群和B群，其核苷酸序列同源性为70.8％，氨基酸序列同源性为67.5％，但与各自同一等位基因群内的毒株的核苷酸序列同源性则达到93.2％～99.6％。 本研究进一步将两个毒株的NS1基因分别插入pET-28a表达载体质粒中，构建了原核表达载体质粒pET-174NS1和pET-52NS1。将其转化进E.coliBL21(DE3)中，经IPTG诱导表达后，产生分子量约为30Ku的特异产物。经Westernblotting印迹分析证实该表达产物可与抗H1、H3、H5、H9等亚型AIV的多克隆抗体良好结合。 之后，本研究利用高效液相色谱仪对表达蛋白进行了亲和纯化，纯化后的蛋白纯度达95％以上。用该纯化蛋白作为包被抗原建立了一种用于检测抗NS1蛋白特异性抗体的间接ELISA方法(简称NS1-ELISA)。方阵滴定结果表明：NS1蛋白抗原最佳包被浓度为2.8μg/孔，血清样品最佳稀释浓度为1∶200。用多克隆血清对表达的NS1(A)与NS1(B)蛋白的抗原性进行研究后发现，NS1蛋白的抗原性非常相似，不同亚型毒株之间存在明显的交叉反应，只是在数值方面有所差异。 用新建立的NS1-ELISA方法对306份经禽流感灭活苗免疫的鸡血清进行检测，计算其S/P值的平均值。结果表明，样本平均值等于0.999，标准差(SD)等于0.076，求得该方法的阳性判定临界值为0.25。用NS1-ELISA分别检测鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、减蛋综合症病毒感染的血清，结果均为阴性，表明该方法的特异性好。通过检测62份禽流感病毒感染鸡的血清，有55份为阳性，该方法的敏感性为88.7％。通过批内和批间重复试验证明NS1-ELISA方法的吸收变异系数小于10％，说明此方法重复性好。同时，研究还发现，实验鸡感染H9亚型AIV后第7d可测到NS1抗体，14d～21d抗体水平达到峰值，之后开始下降。而接种AI灭活疫苗的鸡不产生抗NS1蛋白抗体。