目的:通过体外实验和体内实验两个方面研究不同剂量桂郁金多糖的抗凝血作用及机制,为桂郁金的临床研究提供科学依据。方法:(1)桂郁金多糖对H2O2致人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤的的保护作用及机制研究:对HUVECs进行体外培养,用不同浓度H2O2损伤HUVECs,采用CCK-8法,确定H2O2最佳损伤浓度为500μmol/L。然后给予不同浓度的桂郁金多糖对H2O2损伤的HUVECs进行保护,用 CCK-8 法,确定 62.5μg/mL、125μg/mL、250μg/mL 作为桂郁金多糖的低、中、高剂量组。采用试剂盒测定一氧化氮(NO)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA);通过酶联免疫(ELISA)法检测细胞中6-酮前列腺素F1a(6-keto-PGF1a)、内皮素 1(6-keto-PGF1a)、前列环素(PGI2)、内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、纤溶酶原激活物抑制因子(PAI-1)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)、白介素6(IL-6)的含量表达。采用Hoechst 33258荧光染色法对细胞凋亡情况进行观察;并采用qRT-PCR测定细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3三个基因的表达情况。(2)桂郁金多糖对大鼠的抗凝作用及机制研究:1.将SPF级大鼠随机分为正常组、阿司匹林(20mg/kg)、桂郁金多糖30mg/kg、150mg/kg、300mg/kg五组,测定大鼠血浆PT、TT、APTT。2.采用酶联免疫(ELISA)法对大鼠体内血栓素B2(TXB2)、前列环素(PGI2)、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、纤溶酶原激活物抑制因子(PAI-1)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)、白介素6(IL-6)的含量进行检测。结果:(1)CCK-8法检测结果表明,给药时间24h后,桂郁金多糖在15.625μg/mL～500μg/mL浓度范围内,能够促进细胞增殖,而浓度增大后,桂郁金多糖则对细胞有一定的抑制作用。实验发现,不同浓度桂郁金多糖能够对抗H2O2对HUVECs细胞所造成的损伤。与模型组比较,桂郁金多糖能够使LDH、MDA、ET-1、PAI-1、IL-6、TNF-a的含量减少,使 SOD、GSH-Px、NO、eNOS、6-keto-PGF 1a、PGI2、t-PA 的含量增加。Hoechst 33258荧光染色结果表明,与正常组比较,模型组HUVECs细胞核呈亮蓝色荧光,细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光,细胞密度降低;与模型组比较,桂郁金多糖给药组的蓝色荧光强度降低,细胞凋亡典型形态减少。qRT-PCR实验结果显示,与正常组比较,模型组减少Bcl-2的表达,增加Bax、Caspase-3的表达;与模型组比较,桂郁金多糖给药组能够增加Bcl-2的表达,减少Bax、Caspase-3的表达。(2)实验结果显示,桂郁金多糖能够延长大鼠血浆TT、PT、APTT的时间,酶联免疫(ELISA)法检测结果表明:桂郁金多糖能够增加大鼠血清中PGI2、t-PA的含量;减少TXB2、IL-6、TNF-a、PAI-1的含量。结论:(1)桂郁金多糖对氧化损伤的HUVECs的保护作用,可能与减少LDH、MDA,增加SOD、GSH-Px的含量,抑制促血栓物质PAI-1、缩血管物质ET-1的生成;增加扩血管物质PGI2、NO、eNOS和抗凝血物质t-PA的生成;减少炎症因子IL-6、TNF-α的产生等有关。(2)桂郁金多糖对H2O2致HUVECs细胞的氧化损伤具有一定的保护作用,可能与调控Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达有关。(3)桂郁金多糖具有抗凝血作用,其机制可能与增加抗凝物质t-PA及扩血管物质PGI2的生成;减少缩血管物质ET-1和促血栓物质TXB2、PAI-1的生成有关。同时桂郁金多糖还能减少IL-6、TNF-α炎症因子的生成。(4)体内和体外实验研究结果表明,桂郁金多糖通过改善细胞活性、血小板与内皮功能、纤溶系统、氧化应激、炎症因子、细胞凋亡等方面,抑制血栓形成,从而发挥抗凝血的作用。