论文部分内容阅读
在开花植物中雄性生殖发育涉及一系列复杂的生物学事件,需要精确的转录调控才能完成这一生物学过程。尽管已报道了一些调控绒毡层发育和花粉形成的转录因子,但是对乌氏体形态和花粉壁形成的转录调控机理尚不是很清楚。本研究在辐射诱变中恢8015的突变体库中,鉴定分离出了一个雄性败育的突变体为tip3（TDR interacting protein 3）,进而对其调控基因进行了图位克隆和功能分析。另一方面,在中恢8015背景下敲除了拟南芥MS1的同源基因,并进一步研究了该基因在水稻绒毡层PCD和花粉外壁形成过程中的作用机理。具体研究结果如下:1.与野生型相比,突变体tip3营养生长正常,但是tip3花药泛白、变短,无成熟的花粉粒。通过细胞学观察发现,tip3中小孢子母细胞能够经历减数分裂产生形态正常的二分体和四分体,但是其乌氏体形态异常,无花粉外壁形成,绒毡层降解延迟。2.利用tip3突变体与中恢8015杂交获得的F2进行遗传分析表明tip3不育性状受一对隐性核基因控制,进而利用tip3突变体与粳稻02428杂交构建的F2分离群体将tip3不育基因定位在水稻3号染色体S20-29和S20-35两个分子标记之间,物理距离为21.4 kb。对候选基因测序发现在ORF3的第三个外显子中有两个碱基（AG）缺失。通过转基因互补实验和CRISPR/Cas9敲除证明了TIP3是控制tip3突变体绒毡层降解延迟和花粉壁形成缺陷性状的基因。该基因编码保守的PHD-finger蛋白,在绒毡层和发育中的小孢子中高表达。进化分析表明TIP3与已知的PHD-finger蛋白有各自不同的进化方向,暗示TIP3可能具有不同的功能。3.亚细胞定位表明TIP3定位在细胞核中,酵母转录自激活活性分析表明TIP3具有转录自激活活性,然而PHD结构域并不具有激活活性。酵母双杂交和双分子荧光互补实验证明TIP3与花药发育调控因子TDR互作。此外,qPCR分析表明TIP3突变影响了绒毡层发育和降解以及孢粉素前体合成与转运相关基因的表达。4.通过CRISPR/Cas9技术在中恢8015背景下编辑拟南芥MS1的同源基因,获得了完全不育的纯合突变体,命名为osms1。该突变体花药变小泛白,无可见的花粉粒产生,雄性不育。细胞学观察结果显示osms1中绒毡层PCD延迟,花粉壁柱状结构缺失,花粉形成缺陷。5.OsMS1编码PHD-finger蛋白,定位在细胞核中,是个转录激活子,并且羧基端的12个氨基酸起到激活作用。Y2H和BiFC实验证明OsMS1可以与OsMADS15和TIP2蛋白相互作用。qPCR结果表明,与绒毡层PCD和花粉壁生物合成相关的基因如EAT1、AP37、AP25、OsC6和OsC4在osms1中表达量显著降低。这些结果表明OsMS1通过其PHD结构域与已知的绒毡层调控因子相互作用,调控水稻绒毡层PCD和花粉外壁的形成。