论文部分内容阅读
目的探讨脾源性酪氨酸激酶syk信号通路以及胞内其它常见蛋白激酶(如JNK,P38MAPK以及P13K等)信号通路在单增李斯特菌(LM)感染小鼠腹腔巨噬细胞过程中对炎症复合体活化与装配的作用。方法将小鼠腹腔巨噬细胞随机分为BAY处理组、SP处理组、SB处理组、WO处理组、未处理组以及阴性对照组(NI),每组设3个复孔。BAY处理组、SP处理组、SB处理组、WO处理组分别用syk抑制剂BAY117082,JNK抑制剂SP600125,P38MAPK抑伟制剂SB203580以及P13K抑制齐wotamine预处理小鼠腹腔巨噬细胞1h,除阴性对照组外,其余各组巨噬细胞感染野生型LM (WT-LM)24h, ELISA检测上清液中白细胞介素(IL)-18表达水平；免疫荧光观察细胞内炎症复合体的关键蛋白组分细胞凋亡相关蛋白ASC斑点(ASC-speck)的形成情况；Westernblot检测WT-LM感染小鼠腹腔巨噬细胞不同时相点蛋白syk以及JNK的磷酸化水平变化情况,同时使用LM的△hly和△hly::hly突变株感染细胞观察syk以及JNK蛋白的磷酸化水平变化。同时利用NLRP3炎症复合体的特异刺激物(ATP)刺激BAY处理组与SP处理组巨噬细胞3h,ELISA检测上清液中IL-18的水平；免疫荧光观察细胞内ASC-speck的形成情况；使用AIM2炎症复合体特异刺激物(Poly(dA：dT))及IPAF炎症复合体特异刺激物(鞭毛蛋白-flagellin)分别刺激SP处理组细胞,ELISA检测上清液中IL-18的表达水平。结果BAY处理组小鼠腹腔巨噬细胞感染LM后IL-18的表达水平与未处理组相比明显降低(P<0.05),其它几种蛋白激酶抑制剂处理组中,只有SP处理组IL-18的表达水平与未处理组相比明显降低(P<0.05),而且降低的程度与BAY处理组相似,而SB处理组和WO处理组小鼠腹腔巨噬细胞的IL-18表达水平与未处理组相比,差异均无统计学意义(P>0.05),免疫荧光结果显示BAY处理组与SP处理组小鼠腹腔巨噬细胞经LM刺激后,胞内ASC-speck阳性的细胞百分比均明显低于未处理组(P<0.01)。Western b1ot结果表明野生型LM感染过程中JNK的磷酸化水平10min时明显升高,在40min时达到最高水平,持续至少120min,同时syk的磷酸化水平在感染5min即可被检测到,进一步证实syk与JNK在LM感染过程中发挥着重要的作用。LM的△hly和△hly::hly突变株感染巨噬细胞过程中,JNK蛋白的磷酸化水平在△hly突变株感染后40min仍有显著表达,但在80min和120min出现骤然减弱,而syk磷酸化水平表达趋势发生变化,野生型LM和△hly: hly-LM感染组,p-syk的表达高峰均出现在感染后15min,在30min时表达量均减少,而△hly-LM感染组p-syk的表达高峰与野生型LM组p-syk的表达高峰相比,出现高峰延迟,高峰时间点出现在感染后30min时,结果表明,syk与JNK信号通路在调节LM感染后炎症复合体的过程中,LM的主要毒力因子LLO可能是其重要的调控靶点。为进一步探究JNK和syk信号通路是否特异性的促进LM感染过程中炎症复合体的活化,ATP刺激BAY处理组及SP处理组后发现,只有SP处理组的IL-18表达水平及胞内ASC-speck的百分比数量与未处理组相比明显降低(P<0.05),而BAY处理组的IL-18表达水平与未处理组相比无明显变化；Poly(dA：dT)及鞭毛蛋白分别刺激SP处理组后,结果显示Poly(dA：dT)刺激实验中,SP处理组的IL-18表达水平明显降低(P<0.05),而鞭毛蛋白刺激实验中的SP处理组IL-18水平与未处理组相比,差异无统计学意义。结论综上所述,syk信号通路及JNK信号通路参与调控单增李斯特菌感染过程中炎症复合体的活化,而且在调节过程中,syk和JNK蛋白磷酸化变化水平与LLO密切相关。而且,syk信号通路特异性地调控LM感染中炎症复合体的活化,而JNK信号通路可能非特异性参与NLRP3以及AIM2炎症复合体形成的过程中。