国家海洋局2012年设立了海洋公益性行业科研专项——“几种重要海洋药用生物种质资源发掘、保藏和利用”,该项目由国家海洋局第三海洋研究所主持,南京中医药大学作为主要参与单位,负责“海洋药用生物的活性研究”的任务。项目要求我们针对海洋生物医药开发中药用资源缺乏的瓶颈问题,重点开展蜈蚣藻中蜈蚣藻氨酸制备及降血糖活性研究、星虫激酶抗血栓活性研究、荔枝螺解热抗炎功效评价、鬼鲉免疫调节活性鲉鱼肝肽的分离纯化及活性研究,为海洋药用生物资源的产业开发提供有力的科学依据与技术支撑。根据课题任务的要求,本论文研究工作通过设计不同药理水平的生物活性评价方法,开展荔枝螺解热抗炎抗氧化活性、星虫抗血栓活性、鬼鲉肝脏增强免疫活性以及蜈蚣藻降低血糖活性的研究,从而确定适宜于大样本筛选、又能很好地反映其活性的评价方法。论文共分为五章,第一章系统地综述了四种海洋药用生物的研究进展。第二章到第五章为实验部分,具体研究内容与结果如下:第二章黄口荔枝螺解热抗炎抗氧化活性评价研究第一节黄口荔枝螺样品制备将荔枝螺的软体和螺壳进行分离。软体部分进行匀浆离心,上清液冷冻干燥,得到软体冻干粉;螺壳进行干燥粉碎,得到螺壳粉。对荔枝螺的软体部分进行细分,分为内脏团和腹足。内脏团一部分经沸水浴烫30 min,再进行匀浆冻干,另一部分直接进行匀浆冻干;腹足的处理同内脏团,共得制备样品7个。第二节解热活性评价采用干酵母致大鼠发热整体动物模型来评价荔枝螺(TLST-1,0.42 g/kg,临床等效量;TLSH-2,1.80 g/kg,临床等效量;TLST-2,0.80 g/kg,临床等效量;TLSH-3,0.79 g/kg,临床等效量;TLSH-5,0.35 g/kg,临床等效量)解热抗炎活性,并且检测模型大鼠体内的前列腺素 E2(prostaglandin E2,PGE2)、环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate cAMP)、Na+/Ca2+、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)α、白细胞介素 1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素 2(interleukin-2,IL-2)、白细胞介素 6(interleukin-6,IL-6)含量的变化探讨荔枝螺解热的作用机制。结果表明,荔枝螺螺壳和软体样品均能显著抑制干酵母致热大鼠体温的上升,并且与阳性药阿司匹林相比显示出更加持久的药效,同时荔枝螺螺壳解热活性强于荔枝螺软体;荔枝螺螺壳和软体样品解热的作用机制可能与抑制发热大鼠体内 PGE2、cAMP、Na+、Ca2+、Na+/Ca2+、TNFα、IL-1β、IL-2 和 IL-6 的含量有关。第三节抗炎活性评价采用二甲苯致小鼠耳肿胀、角叉菜胶致小鼠足肿胀、角叉菜胶致大鼠足肿胀致炎模型来综合评价荔枝螺(TLST-1,0.32g/kg,1/2倍临床等效量;TLST-1,1.27g/kg,2倍临床等效量;TLSH-1,1.32g/kg,1/2倍临床等效量;TLSH-1,5.29g/kg,2倍临床等效量)抗炎活性,并且检测模型大鼠体内的PGE2、cAMP、Na+/Ca2+、TNFα、IL-1β、IL-2、IL-6、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量的变化探讨荔枝螺抗炎的作用机制。结果表明,荔枝螺螺壳和软体样品对二甲苯致小鼠耳廓肿胀、角叉菜胶致小鼠足跖肿胀和角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的急性炎症模型具有较强的抑制作用;并且能够抑制炎症大鼠血浆和组织中PGE2、TNFα、IL-1β、IL-2和IL-6含量的升高,明显抑制组织中NO的过量释放,减少了其细胞毒作用;还具有抗氧化能力,增强SOD活力,清除氧自由基,减少丙二醛的释放,避免机体损伤。第四节抗氧化活性评价采用2,2-二苯基-1-苦肼基(DPPH)自由基清除率法研究荔枝螺软体(TLST-1终浓度分别为 1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5.0 mg/mL、10.0 mg/mL、20.0 mg/mL)和螺壳样品(TLSH-2终浓度分别为 1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5.0 mg/mL、10.0 mg/mL、20.0 mg/mL,TLSH-3终浓度分别为 0.31 mg/mL、0.62 mg/mL、1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5.0 mg/mL)的抗氧化活性。结果表明,荔枝螺螺壳和软体样品均具有抗氧化活性,并且在一定范围内,具有剂量依赖关系,样品浓度越高,样品的抗氧化活性越好。第三章光裸星虫溶解血栓活性评价研究第一节光裸星虫样品制备对星虫进行解剖分离,得到体壁+内脏、体腔液。体腔液单独收集,体壁+内脏进行剪碎处理,经反复冻融2次、再经匀浆充分抽提后,和体腔液分别离心均得到上清液和沉淀,体壁+内脏上清液冷冻干燥,其沉淀经水提处理;体腔液上清液和沉淀均进行冷冻干燥,共得制备样品4个。第二节溶解血栓活性评价以二磷酸腺苷(ADP)诱导血小板聚集,采用比浊法观察星虫提取物对家兔体外血浆血小板6 min聚集率和最大聚集率的影响;采用凝固法来评价星虫提取物对家兔体外血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血激酶时间(APTT)及凝血酶时间(TT)的影响;采用动静脉旁路模型,来研究星虫提取物(SN-1,0.15g/kg,4倍临床等效量;SN-2,0.10g/kg,4倍临床等效量;SN-3,0.24 g/kg,4倍临床等效量)对大鼠动静脉旁路血栓形成的影响;采用DPPH自由基清除率法,来评价星虫提取物清除OH自由基的作用;通过纤维蛋白平板实验研究星虫提取物的纤溶活性。结果表明,星虫提取物能明显抑制ADP诱导的家兔体外血小板6 min聚集率和最大聚集率,能明显延长家兔PT、APTT和TT,明显抑制大鼠动静脉旁路血栓形成,减轻血栓湿重和干重;具有清除OH自由基的作用以及不同程度地溶解纤维蛋白的作用。第四章日本鬼鲉肝脏增强免疫活性评价研究第一节日本鬼鲉肝脏样品制备取出鬼鲉肝脏,进行剪碎处理去除血管与结缔组织后,将肝脏剪碎,进行匀浆、反复冻融3次后,在95℃下加热5 min。冷却至室温,在4℃条件下离心,得到的上清液进行冷冻干燥,得制备样品1个。第二节增强免疫活性评价鬼鲉肝脏提取物设立了低、中、高三个剂量(分别为0.25 g/kg、0.5 g/kg、1.0 g/kg)采用环磷酰胺诱导建立免疫低下动物模型,免疫器官重量法测定胸腺指数和脾脏指数,碳粒廓清法测定小鼠单核巨噬细胞的功能,绵羊红细胞免疫法测定小鼠体液免疫功能,采用血细胞计数仪检测小鼠外周血常规,采用ELISA方法测定小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6的水平,采用流式细胞仪测定脾细胞周期,采用HE染色观察脾脏和胸腺组织形态并进行评分。结果表明,鬼鲉肝脏提取物可以减缓免疫低下小鼠体重的下降趋势,减少免疫低下小鼠脾脏和胸腺的损伤,促进免疫低下小鼠脾细胞的分裂和增殖,可以增加免疫低下小鼠单核巨噬细胞吞噬功能和血清溶血素含量,并且可以增加免疫低下小鼠白细胞数、中性粒细胞数、淋巴细胞数和单核细胞数和血清中TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6的含量。第五章亚洲蜈蚣藻降低血糖活性评价研究第一节亚洲蜈蚣藻样品制备蜈蚣藻进行水提,然后浓缩,浓缩液进行醇沉,24h后抽滤,得到上清液与沉淀。上清液进行浓缩,并除去乙醇;沉淀用无水乙醇冲洗,挥去乙醇后,再进行冷冻干燥,得到冻干粉,共得制备样品2个。第二节降低血糖活性评价采用基于四氧嘧啶型糖尿病小鼠整体动物模型的体内实验来评价蜈蚣藻提取物(GA-1低剂量组,1.76 g/kg,临床等效量;GA-1中剂量组,3.52 g/kg,2倍临床等效量;GA-1高剂量组,7.04 g/kg,4倍临床等效量;GA-2低剂量组,0.26g/kg,1/8临床等效量;GA-2中剂量组,0.52 g/kg,1/4临床等效量;GA-2高剂量组,1.04 g/kg,1/2临床等效量)调节血糖的活性。结果表明蜈蚣藻多糖部位和非多糖部位均具有降低四氧嘧啶型糖尿病小鼠的血糖水平,主要表现为可以控制小鼠体重下降的程度,缓解小鼠的脏器损伤,能显著的降低高血糖小鼠的血糖,减轻胰岛炎症的作用,并且非多糖部位可以抑制抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用。结论:本论文通过建立解热抗炎效应评价体系来研究荔枝螺螺壳与软体的解热抗炎活性,以及采用DPPH法研究荔枝螺抗氧化的活性,建立溶解血栓活性评价体系来研究星虫溶解血栓的活性,建立免疫活性评价体系来研究鬼鲉肝脏增强免疫的活性,建立调节血糖活性评价体系来研究蜈蚣藻调节血糖的活性,研究发现荔枝螺螺壳和软体提取物均具有解热抗炎的作用,星虫提取物具有溶解血栓的活性,鬼鲉肝脏提取物具有增强免疫的活性,蜈蚁藻多糖部位和非多糖部位均具有调节血糖的活性。本论文的特色:1.首次通过整体动物模型对荔枝螺的可食用部位(软体)和遗弃部位(螺壳)进行了系统评价,发现它们均具有很好的解热抗炎活性,已经申请专利并获得授权,为荔枝螺的综合利用与开发提供了科学依据。2.首次对鬼鲉肝脏提取物进行了免疫活性研究,发现其具有增强免疫作用。3.对蜈蚣藻水提取物的醇沉沉淀和溶液进行了降血糖活性比较研究,首次发现其醇沉后的溶液部分具有很好的降血糖作用。