研究背景现代社会缺血性心脏病的发病率成逐年增高趋势,其主要治疗措施以促进和恢复冠状动脉血供,减轻心肌缺氧和改善冠状动脉硬化为主,主要治疗方法包括冠脉搭桥术(CABG)和经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)。尽管治疗方面进展迅速,但仍有相当一部分患者由于完全性或弥漫性血管阻塞等情况不适于接受常规血管成形术,或因术后症状复发不能再接受此类血运重建术治疗。针对上述临床难题,如何有效挽救此类患者心肌,改善其心功能又成为一个困扰医学界的难题。而近年提出的“治疗性血管新生”概念为此类患者带来了新的希望[1-6]。目前治疗性血管新生的方法主要有“细胞铺路”、“分子搭桥”和“基因治疗”,虽然大量基础研究证实这三种方法能促进缺血组织血管新生,但其临床试验结果尚存争议[7, 8]。因此寻求一种有效的促血管新生的方法显得尤为重要。已有研究显示低频脉冲磁场(LFPMFs)有改善微循环,促进人脐静脉内皮细胞及牛主动脉内皮细胞增殖、迁移等生物效应,并且无创、安全、可靠,这提示LFPMFs可能成为经济有效的促血管新生方法,但是目前尚无有关于LFPMFs对缺血性心脏病治疗性血管新生疗效方面的研究报道[9-11]。本课题拟以心肌梗死大鼠和大鼠心肌微血管内皮细胞(CMECs)为研究对象,观察和探讨LFPMFs对缺血心肌是否具有治疗性血管新生的作用及其可能的机制。研究目的1.研制低频脉冲磁场治疗仪,设置磁场强度和频率在一定范围内可以调节,并制备细胞用和动物用两种不同规格的感应线圈。2.建立心肌梗死大鼠模型,明确低频脉冲磁场能否促进缺血心肌的血管形成及曝磁参数,并阐明其可能机制。3.分离、纯化培养心肌微血管内皮细胞,明确低频脉冲磁场对心肌微血管内皮细胞增殖、迁移的影响。研究方法1.根据电磁场理论设计研发低频脉冲磁场治疗仪,的由单片机产生与控制脉冲磁场,高速电流传感器自动测量感应线圈中的脉冲电流强度,通过峰值保持电路将磁场强度测量结果输送至显示器,脉冲磁场以多路同时驱动方式输出。磁场频率和场强为可调方式,并在感应线圈有效匀磁场范围内配以有机玻璃支架。本实验研究方波激励脉冲波对心肌微血管内皮细胞和心肌梗死大鼠促血管新生的生物效应。2.选取8周龄180～200g雄性Sprague-Dawley大鼠,以左侧第3-4肋间为入路,暴露心脏,结扎冠状动脉前降支,建立心肌梗死动物模型。3.术后4周左室心导管技术检测大鼠心功能,八道生理记录仪记录心电图、动脉血压、±LVdp/dtmax等生理学指标。4.免疫组化法检测心肌梗死交界区毛细血管,显微镜下随机选取区域并用软件分析毛细血管密度;检测心肌微血管内皮细胞VIII以及vWF特异蛋白表达情况。5.2,3,5-氯化三苯基四唑氮(TTC)染色检测大鼠心肌梗死面积,Image J分析测定结果。6.ELSA Kit检测大鼠循环血中VEGF、bFGF的表达水平。7.蛋白质质谱分析技术检测接受磁场治疗的大鼠缺血心肌与正常大鼠心肌的差异蛋白表达情况。8.HE染色观察重要大鼠重要脏器的形态和结构特点。9.无菌分离成年大鼠左心室组织,去除内外膜及冠脉组织,心肌剪为1mm3组织块,经酶消化,条件培养及纯化细胞后获得CMECs。10.乙酰化低密度脂蛋白吞噬法(Dil-Ac-LDL)鉴定CMECs。11.流式细胞计数检测CMECs纯度12. Western blot方法检测大鼠缺血心肌中VEGF、KDR(VEGFR2)、bFGF、FGFR2蛋白表达量。13. MTT检测CMECs增殖活性。14.划痕法检测CMECs迁移平均距离。15. Millicell小室检测CMECs迁移率。16.硝酸还原酶法测定CMECs NO释放量。研究结论1.心肌梗死大鼠经15Hz 6mT磁场每日干预2小时,持续2周,能显著改善心功能,减少心肌梗死面积,并促进缺血梗死交界区毛细血管新生。2. 15Hz 6mT磁场的生物效应可能与磁场促进缺血心肌中VEGF/KDR(VEGFR2)系统以及bFGF/FGFR2系统激活,以及促进循环血中VEGF、bFGF水平升高相关。3. 15Hz 6mT磁场具有促进心肌微血管内皮细胞增殖、迁移和分泌NO的作用。