手足口病（Hand-foot-and-mouth disease,HFMD）是一种由多种人肠道病毒（Human enterovirus,HEVs）引起的接触性传染病,多发于五岁以下婴幼儿,偶发于青少年和成人。HFMD典型的临床症状是:发热,手、足及臀部出现皮疹、疱疹或斑丘疹,无菌性脑膜炎,急性弛缓性麻痹,甚至导致死亡。自2008年5月2日起,HFMD作为第38种传染病被纳入我国《传染病防治法》的丙类法定报告传染病管理。据国家疾病控制中心（CDC）网站统计,在2006年至2019年,中国共计报告手足口病病例数为22,715,730例,其中死亡比例为3,396例,死亡率约为0.015%。从2015年开始,手足口病的死亡率开始明显下降,但发病率仍居高不下。随着2016年EV-A71灭活疫苗的上市,由EV-A71感染的HFMD病例数占比呈下降趋势。根据本研究室在2016-2019年对湖北省、江苏省多地区的流调结果分析,CV-A6、CV-A10、CV-A16已经取代EV-A71,成为这些地区引起手足口病的主要病原体。为了更好预防手足口病的爆发,研发包含EV-A71、CV-A6、CV-A10、CV-A16在内的手足口病多价疫苗刻不容缓。目前关于CV-A6、CV-A16、EV-A71的小鼠主动或被动保护模型已有大量文献报道,人肠道病毒A和B组的大部分血清型病毒的易感鼠龄仅为3日龄。小日龄小鼠的免疫系统发育不完全、无两次疫苗免疫后攻毒时间间隔,无法对疫苗效力做出合理的评价,故急需一种建立在大日龄小鼠基础上的主动保护模型。它可以完全模拟小鼠自然状态下疫苗接种与预防传染病的过程,模拟易感人群2次暴露同一病原体后的免疫应答和疾病预防过程,为候选疫苗的保护效力及耐受性做出更为可靠的评估,为候选疫苗的临床研究提供效力参考数据。本研究通过建立可以致死14日龄小鼠的主动保护模型,对CV-A10单价候选疫苗进行了全面的评估。本研究通过10层Vero细胞工厂培养CV-A10-L12病毒,将其进行超滤浓缩、蔗糖垫底及Cs Cl密度梯度离心,分离并纯化CV-A10-L12的空心颗粒（EP）和实心颗粒（FP）,分析自然条件下CV-A10的EP与FP比例（约为4:6）。将EP/FP混合样品（Mixed particles,MP,EP:FP=4:6）与0.18 mg/剂的Al（OH）3佐剂配制CV-A10候选疫苗。通过TEM观察EP、FP和MP灭活前后的颗粒完整度及甲醛对病毒颗粒是否存在影响。通过SDS-PAGE、Western Blot对EP、FP和MP的含量和纯度进行分析。研究表明,CV-A10候选疫苗的纯度较高,约为92%。本研究将制备的CV-A10候选疫苗免疫6-8周龄的Balb/c小鼠,对CV-A10候选疫苗引起的体液及细胞免疫进行了研究。免疫原性可以作为疫苗效力的重要参考指标。在本研究中CV-A10候选疫苗初次免疫后的阳转率为60%,加强免疫后为100%,中和效价约为48。通过研究加免后第14天,经结构蛋白多肽刺激后,小鼠脾脏淋巴细胞中TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6等细胞因子的特异性表达,发现CV-A10候选疫苗可以引起细胞免疫应答。此外,本研究通过设计涵盖CV-A10 P1区全部多聚蛋白的多肽段,对CV-A10引起T细胞免疫的表位进行了研究,研究表明位于CV-A10 VP1/VP3 C端的多肽可引起强烈的T细胞刺激反应。这为研究CV-A10新型肽疫苗及其它重组蛋白疫苗提供了重要的思路和策略。本研究室通过鼠脑适应性传代成功获得一株可以致死12日龄小鼠的CV-A10-M12毒株。通过以MOI=0.01在10层RD细胞工厂中培养CV-A10-M12病毒,通过超滤浓缩将其体积浓缩35倍,成功获得可以致死14日龄的小鼠攻毒株,记为CV-A10-M14,并进行LD50测定。以CV-A10-M14建立了小鼠的主动免疫-攻毒保护模型,通过腹腔注射含有Al（OH）3佐剂和0.5μg或2.0μg抗原的CV-A10候选疫苗及等量Al（OH）3佐剂制备的对照样品,在小鼠3日龄时进行初次免疫,9日龄时加强免疫,14日龄时注射致死剂量的CV-A10-M14。攻毒后,对小鼠的体重变化、临床评分及存活率进行监测,并在Al（OH）3佐剂组死亡之时采集各组小鼠血清及组织器官进行血清中和效价测定和组织病毒载量测定。研究表明,CV-A10候选疫苗具有良好的耐受性和保护效力,0.5μg剂量组的CV-A10候选疫苗的保护率为90%,而2.0μg剂量组的保护率为100%。通过对小鼠组织器官的病理切片及免疫组化分析,为CV-A10病毒的组织嗜性及入侵致病机理提供重要的基础研究,也进一步阐明了CV-A10候选疫苗接种后的免疫应答及病毒清除能力和保护机理。