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【背景】膀胱尿路上皮癌仍是我国发病率最高的泌尿系统恶性肿瘤,可分为非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle-invasive bladder cancer,NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC)。在初诊的膀胱癌病人中,70-80%为NMIBC病人,一般采用经尿道肿瘤电切的微创手术方法治疗,如肿瘤无进展,可达治愈目的。但是,约30%的NMIBC会进展为MIBC,此时即便采用膀胱全切+盆腔淋巴结清扫术,2年内仍有约50%的MIBC病人会出现局部复发,3年生存率小于50%,预后差。但是,目前临床上缺乏预测NMIBC进展风险的分子标志物,更缺乏阻断膀胱癌进展的靶向药物。因此,针对膀胱癌侵袭进展的分子机制研究意义重大,十分必要。IPO11基因编码的importin11是胞质核转运受体(karyopherins)家族中的一员,可特异性介导生物大分子经核孔复合体入核。近来证据显示,蛋白、核酸等大分子物质在核质和胞质之间的穿梭不仅仅是细胞内结构性的需要,更是一种调控细胞进程的手段,也与肿瘤的进展关系密切,胞质核转运受体是调控核转运过程的重要节点,其表达水平异常显示与肿瘤的发生进展关系密切,但目前尚无IPO11与肿瘤方面的研究。我们前期对3例MIBC的基底肿瘤部分和浅表肿瘤部分以及相应的正常膀胱粘膜进行了外显子组测序研究,结果显示在3例组织中的2例基底肿瘤相对其浅表肿瘤出现IPO11基因拷贝数增加,推测MIBC基底肿瘤的IPO11拷贝数增加可能与膀胱癌的侵袭进展有关。【目的】探讨IPO11拷贝数增加在膀胱尿路上皮癌侵袭进展中的作用及其可能的分子机制。【材料和方法】1.对3例MIBC的浅表肿瘤、基底肿瘤和相应的远离肿瘤的正常膀胱粘膜进行外显子组测序。2.通过Real time q PCR对测序样本及25对接受膀胱癌根治术的膀胱肿瘤的浅表肿瘤和癌旁正常粘膜进行IPO11绝对拷贝数的检测。3.通过FISH方法在上述25例浅表膀胱肿瘤的组织石蜡切片中进行IPO11拷贝数检测。4.通过Real time q PCR对上述25浅表膀胱肿瘤和癌旁正常粘膜进行IPO11m RNA相对表达量检测,分析IPO11拷贝数和m RNA表达的关系。5.通过免疫组化对接受施膀胱癌根治术的134例患者(包括3例测序病人及IPO11拷贝数变异检测的25例病人)的病理石蜡组织切片中importin11的表达进行检测。分析importin11表达与IPO11拷贝数以及IPO11 m RNA表达量的关系,以及importin11表达与临床病理指标的关系和对生存预后的影响。6.在8株膀胱癌细胞株中进行IPO11 m RNA相对表达量的检测。7.通过RNA干扰方法对EJ和5637进行IPO11基因敲减,通过CCK-8实验,细胞划痕实验,Transwell迁移和侵袭实验,流式细胞术检测细胞凋亡和周期的方法,检测下调IPO11基因表达对两种细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响和对细胞凋亡和周期的影响。8.通过EJ细胞裸鼠皮下移植瘤内注射胆固醇修饰的IPO11 si RNA的体内RNA干扰实验比较下调IPO11对移植瘤增殖的影响。9.对野生型EJ细胞和IPO11敲减的EJ细胞进行转录组测序及显著差异表达基因的KEGG pathway分析。10.对转录组测序的显著差异表达基因在野生型EJ细胞和IPO11敲减的EJ细胞中通过Real time q PCR检测IPO11 m RNA的相对表达量。【结果】1.3例外显子测序的MIBC组织中的2例基底肿瘤相对其浅表肿瘤出现IPO11基因拷贝数增加。Real time q PCR和FISH石蜡切片的检测结果验证了外显子组测序对IPO11的拷贝数分析结果,并显示25例膀胱浅表肿瘤有17例存在IPO11拷贝数变异,而且IPO11拷贝数与IPO11 m RNA及蛋白表达量相关。2.134例膀胱癌免疫组化结果显示importin11高表达与膀胱癌的高分期、高分级、淋巴管侵犯和淋巴结转移显著相关,并且显著降低膀胱癌病人的3年总生存率,肿瘤特异生存及无肿瘤生存率,是膀胱癌不良预后的独立危险因子。3.Real time q PCR检测非浸润性膀胱癌细胞株BIU-87和乳头状膀胱癌细胞株RT4的IPO11 m RNA表达量低,而6株浸润性膀胱癌细胞株T24,5637,UM-UC-3,J82,HT1376,EJ的IPO11m RNA表达量显著升高。4.划痕实验和Transwell迁移实验中,敲减IPO11基因后EJ和5637细胞的迁移能力显著下降;Transwell侵袭实验,敲减IPO11基因可以显著抑制EJ和5637细胞的侵袭能力。CCK-8实验结果显示与阴性对照组相比RNA干扰显著降低了EJ细胞的增殖能力,对5637细胞的增殖能力没有显著影响。EJ细胞的皮下移植瘤实验中,实验组平均肿瘤体积和肿瘤重量均有下降,但均没有显著性差异。与阴性对照组相比,下调IPO11显著促进了5637细胞的凋亡,对EJ的凋亡无显著影响。RNA干扰对EJ和5637细胞的细胞周期分布无显著影响。5.野生型EJ细胞和IPO11敲减的EJ细胞的转录组测序的差异基因KEGG pathway分析结果显示Bladder Cancer通路中的CDKN1A和THBS1基因表达显著下调,并通过q PCR实验在野生型EJ细胞和IPO11敲减的EJ细胞中得到了验证。【结论】IPO11的编码蛋白Importin 11在人类膀胱尿路上皮癌组织中高表达。Importin 11高表达与膀胱癌的高分期、高分级、淋巴管侵犯和淋巴结转移相关,是膀胱癌不良预后的独立危险因子,在促进膀胱癌的侵袭、进展的过程中发挥重要作用。IPO11基因拷贝数的增加是importin 11高表达的重要原因,importin11高表达促进膀胱癌进展可能是通过上调CNKN1A和THBS1基因表达实现的。