背景神经病理性疼痛是一种由中枢或外周神经病变或功能障碍引起的疼痛综合征,严重影响病人的生活质量。背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)神经元是初级感觉神经元,负责将外界疼痛刺激转换为内在神经冲动并将其传导至脊髓。目前针对周围性神经病理性疼痛的一些研究集中在DRG神经元的瞬时感受器电位离子通道家族(Transient receptor potential channel, TRP channel)及其功能上。作为TRP通道家族成员之一,瞬时感受器电位离子通道-香草素亚型4(Transient receptor potential vanilloid4, TRPV4, also known as OTRPC4, VRL-2, VR-OAC, and TRP12)是一种非选择性阳离子通道,具有Ca2+子通透性,参与DRG神经元介导的疼痛信号传导过程。Alessandri-Haber等发现沉默TRPV4通道蛋白会导致细胞渗透压调节异常及对低渗性伤害性刺激反应能力下降。此外,TRPV4在炎性物质导致的DRG机械痛觉过敏过程中起重要作用。在长春新碱、酒精中毒、糖尿病及人类免疫缺陷病毒等因素导致的外周神经病变动物疼痛模型中,注射TRPV4反义寡核苷酸会使动物的机械痛觉过敏降低。因此,了解DRG神经元TRPV4通道活动的分子机制对进一步理解疼痛发生发展有重要帮助。然而目前该分子机制,尤其是调节TRPV4表达及功能的机制,还并不完全清楚。研究表明某些细胞上TRPV4的基因表达和功能变化受一些辅助蛋白的调节,如神经元蛋白激酶C酪蛋白激酶底物3(protein kinase C and casein kinasesubstrate in neurons protein3, PACSIN3)、三磷酸肌醇(1,4,5)受体3(inositol1,4,5-trisphosphate receptor type3, IP3R3)及肌动蛋白,但DRG神经元TRPV4受何种因素调节还未有确切的理解。动物DRG的慢性压迫(chronic compression of DRG, CCD)可以模拟临床上椎管狭窄和椎间盘突出等疾病引起的神经根受压症状,是一种典型的神经病理性疼痛模型。我们前期的研究显示TRPV4参与介导CCD诱导的机械痛及热痛觉过敏。进一步的蛋白质组学分析发现CCD会导致15种蛋白的表达变化,膜联蛋白A2(Annexin A2)作为其中的一种蛋白其表达显著上调。膜联蛋白家族(Annexins)是一类主要分布在细胞膜胞质面的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,并在许多生理过程中发挥重要作用包括离子通道的调节。研究证实Annexin A2通过与TRPV5/V6形成功能性复合物而参与TRPV5/V6的膜转运。然而,Annexin A2是否能够与TRPV4相互作用并修饰其功能和或表达尚未报道。在本实验中,我们利用免疫细胞化学和免疫共沉淀技术研究DRG神经元Annexin A2和TRPV4两蛋白间的相互作用。通过实时定量逆转录聚合酶链反应(real time reverse transcription-polymerase chain reaction, Real Time RT-PCR)、蛋白免疫印迹法及Ca2+荧光成像技术进一步研究Annexin A2对TRPV4功能及表达方面的调节作用。目的研究膜联蛋白A2对大鼠DRG神经元TRPV4的调控。方法1.DRG神经元培养取新生1天Wistar大乳鼠L2-L6的DRG,1mg/ml的胶原酶与0.25%的胰酶37℃水浴箱消化50分钟,加入10%血清终止消化。应用吸管轻柔反复吹打至细胞悬液。200目滤网过滤去除未分散的组织块。在含2%B27和1%神经生长因子(NGF)的Neurobasal基础培养液中培养。每2天更换培养基1次,培养第4天的DRG神经元用于后续实验。2.免疫细胞化学DRG神经元培养4天后,冷丙酮-20℃固定细胞10分钟,加入2%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)室温封闭1小时,TRPV4(5ug/ml)与AnnexinA2(20ug/ml)一抗4℃孵育过夜。次日,加入带有荧光标记的相应二抗室温孵育1小时。细胞核使用DAPI染色2分钟。封片,荧光显微镜下观察TRPV4与Annexin A2在DRG神经元的定位区域。3.免疫共沉淀收集DRG神经元,加入细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂)冰上裂解30分钟。4℃14000g离心10分钟,转移上清(总蛋白)至新EP管。总蛋白中加入Protein A+G agarose,4℃摇晃30分钟以去除非特异性杂蛋白。4℃14000g离心10分钟,转移上清至新EP管以去除Protein A+G agarose。总蛋白中加入抗体4℃水平缓慢摇晃孵育过夜。次日加入Protein A+G agarose,4℃水平缓慢摇晃孵育2小时。4℃3000g离心5分钟,将protein A+G agarose离心至管底。去掉上清,收集管底agarose-抗原抗体复合物,预冷PBS洗5遍。加入上样缓冲液重悬agarose-抗原抗体复合物,95℃煮沸5分钟以游离抗体、琼脂糖珠及蛋白。Western blot分析。4. Annexin A2siRNA干扰将DRG神经元以1×105/ml的密度接种在96孔板上,培养4天后加入100nmol/L的Accell Annexin A2siRNA1ul+97ul Accell delivery media+2%B272u1,培养72小时后提取RNA与蛋白检测Annexin A2及TRPV4mRNA及蛋白表达情况以检验Annexin A2对TRPV4表达的调节作用,同时进行细胞内[Ca2+]i的测量以观察Annexin A2对TRPV4的功能调节作用。5.实时定量RT-PCR检测从各组DRG神经元中提取RNA,实时定量RT-PCR检测Annexin A2及TRPV4mRNA表达的变化。6. Western blotting检测从各组DRG神经元中提取蛋白质,Western blotting检测Annexin A2及TRPV4蛋白表达的变化。7.Ca2+成像实验Ca2+荧光探针(Fluo-3/acetoxymethyl ester, Fluo-3/AM)从-20℃冰箱中取出,室温下复温,应用含有0.02%pluronicF127的等渗溶液将其配制成终浓度5umol/L。DRG神经元PBS冲洗1次后加入Fluo-3/AM,室温下负载30分钟,负载过程中可轻轻摇晃促进染色,然后PBS冲洗2次。将孵育完的DRG神经元放在LCSM的载物台上,488nm激光激发Fluo-3,观察细胞内Ca2+荧光强度的变化。实验应在室温下(<24℃)进行,且在给予药物刺激之前,应先测量细胞内Ca2+荧光强度至少30秒作为基础值。然后应用TRPV4的激活剂4a-phorbol12,13-didecanoate (4a-PDD,1Oumol/L)刺激3分钟,观察施加药物前后荧光强度变化。结果1.免疫荧光检测Annexin A2与TPRV4在DRG神经元的定位区域Annexin A2与TRPV4在DRG神经元存在部分共定位区域包括细胞膜及细胞质。2.免疫共沉淀检测Annexin A2与TPRV4间的相互作用提取的DRG神经元总蛋白,经anti-TRPV4抗体和protein A+G agarose共沉淀后,用anti-Annexin A2抗体行western blot可检测到沉淀蛋白中的Annex in-A2(39kD)：经anti-Annexin A2抗体和protein A+G agarose共沉淀后,用anti-TRPV4抗体行western blot能检测到沉淀蛋白中的TRPV4(98kD)。上述结果提示Annexin A2与TRPV4通道蛋白之间存在某种关联。3. RT-PCR测量干扰Annexin A2后Annexin A2及TRPV4的mRNA变化Annexin A2:干扰Annexin A2之后,干扰组Annexin A2的mRNA表达降低,与正常对照组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。TRPV4:干扰Annexin A2之后,干扰组TRPV4的nRNA表达降低,但与正常对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。4. Western blot测量干扰Annexin A2后Annexin A2及TRPV4的蛋白变化Annexin A2:干扰Annexin A2之后,干扰组Annexin A2的蛋白表达降低,与正常对照组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。TRPV4:干扰Annexin A2之后,干扰组TRPV4的蛋白表达降低,但与正常对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。5. Annexin A2的下调对TRPV4介导的Ca2+内流的影响与对照组比较,干扰Annexin A2可以明显降低DRG神经元内4a-PDD诱导的TRPV4介导的Ca2+内流(P<0.05),但Ca2+内流并没有完全消失。结论Annexin A2对大鼠DRG神经元TRPV4的功能具有调节作用。背景神经病理性疼痛是由神经系统原发性损害和功能障碍所激发或引起的疼痛。其中根性神经痛是临床常见的疼痛类型,特别是DRG在受到某种伤害性刺激(如腰椎间盘突出、脊髓肿瘤压迫或炎性物质导致的刺激)而引起的疼痛。为理解和探索神经病理性疼痛的发病机制,胡三觉等学者建立了动物背根神经节的慢性压迫CCD模型用以模拟临床上的椎间盘突出和椎管狭窄等症状。CCD大鼠可产生自发性疼痛、机械性疼痛异常和热痛觉过敏,伴随着受压迫神经元的自发性放电增加、动作电位和电流阈值降低。多种离子通道被认为参与传递CCD大鼠持续受压DRG神经元的伤害性刺激,如电压门控性Na+通道和K+通道、超极化激活性阳离子通道和TRP通道等。作为TRP超家族成员之一,TRPV4是近来研究比较多的通道。我们前期的研究显示,CCD大鼠DRG神经元TRPV4的mRNA及蛋白表达均明显升高,且高表达的TRPV4参与介导CCD大鼠的机械性痛觉过敏。此外,前期研究还证实TRPV4参与CCD引起的热痛觉过敏。微管是存在于细胞质内的细胞骨架主要成分之一,参与许多重要的生命活动,包括疼痛的感知和传递。秋水仙碱是一种微管解聚剂,能够通过可逆性结合α-微管蛋白(α-tubulin,TUBA)和β-微管蛋白(β-tubulin,TUBB)阻止微管蛋白异二聚体聚合成微管,破坏微管的动态不稳定性,从而降低皮内注射肾上腺素导致的大鼠后肢痛觉过敏。紫杉醇是一种微管稳定剂,具有结合微管并稳定微管的作用。研究发现大鼠鞘内给予紫杉醇,能够增加后肢对伤害性机械刺激的痛觉过敏。近来有研究发现微管与TRPV4之间可能存在某种功能联系。微管结合蛋白(MAP7)(?)能够与微管特异性结合并辅助微管行使其生理功能。已有报道证实,MAP7能够结合TRPV4C末端片段(798-809位氨基酸残基),并可以提高TRPV4在细胞膜的功能表达。此外,进一步的研究还发现内源性TUBA和TUBB能够与TRPV4C末端直接相连,且应用紫杉醇稳定微管后可以引起TRPV4介导的Ca2+内流的减少和延迟。TRPV4的分布较为广泛,在不同的组织中可能发挥不同的作用,Ca2+内流只是TRPV4通道开放的指标之一。存在于DRG的TRPV4能够感知和传导机械、热等多种伤害性刺激,在神经病理性疼痛中扮演重要角色。但微管是否能够参与TRPV4介导的机械性和热痛觉过敏还有待进一步研究。本实验中,我们通过测量机械刺激缩足反射阈值和热刺激缩足反射潜伏期研究微管对TRPV4介导的CCD大鼠神经行为学反应的影响。通过Ca2+荧光成像技术研究微管对TRPV4介导的CCD大鼠DRG神经元内Ca2+内流的影响。目的研究微管对CCD大鼠DRG神经元TRPV4功能的影响。材料与方法1.建立CCD大鼠模型将体重约200-250g的Wistar大鼠随机分为CCD组和假手术组。大鼠10%水合氯醛(0.3m1/100g,腹腔注射)麻醉后,腰骶部剃毛,常规消毒。沿L4-S1棘突做后正中偏右切口,依次切开皮肤、筋膜及肌肉,钝性分离至横突,暴露右侧L4及L5椎间外孔,将“U”形棒(直径0.63mm,每侧长度4mm)的一端沿L4及L5椎间外孔的前壁上方水平插入椎管内,使之挤压L4、L5DRG,另一端则位于椎管壁外。术后用生理盐水冲洗切口,依次缝合肌肉、腰背筋膜和皮肤,腹腔注射青霉素20万单位3天以预防感染。假手术组除不插钢棒压迫神经节外,其余操作同手术组。术后大鼠没有发生伤侧肢体自噬现象。2.DRG神经元的培养新生1天的大乳鼠,取出L2-L6的DRG,Ⅰ型胶原酶+胰蛋白酶消化50分钟,终止消化并吹打成细胞悬液,应用Neurobasal+2%B27+1%NGF培养。每2天更换培养基,培养第4天的DRG神经元用于后续实验。3.成年大鼠DRG神经元培养取出持续压迫14天大鼠L4-L5的DRG,Ⅰ型胶原酶消化1小时,而后胰蛋白酶消化30分钟,终止消化并吹打成细胞悬液,应用Neurobasal+2%B27培养。每2天更换培养基,培养第4天的DRG神经元用于后续实验。4.神经行为学测定手术前：连续3天测量,每天1次(同一时间段)。术后第14天：药物处理前2小时测量,排除痛觉表现不明显者(<5%)；药物处理后0.5、1、2、4小时分别测量。药物对大鼠机械缩足反射阈值(Mechanical withdrawal threshold, MWT)的测量使用BME-403型、(?)on Frey Fibers机械痛刺激仪进行。先将大鼠放在铁丝网上适应15分钟,由低到高依次使用各种强度的Von Frey纤维刺激大鼠足底中部并维持5秒,出现快速缩足或舔足现象为阳性反应。每个强度的纤维刺激5次,至少能够引发3次缩足反应的纤维强度为机械缩足反射阈值。药物对大鼠热痛觉过敏的影响通过热辐射刺激缩爪反应潜伏期(paw withdrawl latency, PWL)来测量。BME-410A型热痛刺激仪被使用。先将大鼠放在6毫米厚的有机玻璃操作台上适应15分钟,然后将光源焦距对准大鼠后肢足底中心,电子秒表记录从开始照射到引起后肢回缩反应所需的时间,即为热辐射刺激缩爪反应潜伏期。对每肢照射5次的测量结果的均值进行统计。5.Ca2+成像实验应用含有0.02%pluronicF127的等渗溶液配制1mmol/L Fluo-3/AM使其终浓度为5umol/L,并用其孵育DRG神经元30分钟。将孵育完的细胞放在LCSM的载物台上,488nm激光激发Fluo-3,观察细胞内Ca2+荧光强度的变化。结果1.秋水仙碱(colchicine)对CCD大鼠机械及热痛觉阈值的影响鞘内注射不同剂量的秋水仙碱(50ug、125ug、250ug),分别测量注射后0.5、1、2、4小时的机械缩足反射阈值和热辐射刺激缩爪反应潜伏期。结果显示：125-250ug的秋水仙碱对CCD后大鼠机械痛及热痛敏的抑制作用(P<0.05)呈剂量依赖性升高,且此抑制作用于注射后15分钟可测得,30分钟达到高峰,大约能够持续到2小时。2.秋水仙碱对CCD诱导的TRPV4介导的机械及热痛觉阈值的影响鞘内注射250ug秋水仙碱能够明显抑制CCD引起的大鼠机械及热痛敏(P<0.05),但鞘内注射4α-PDD对250ug秋水仙碱的此种抑制作用没有影响(P>0.05)。3.秋水仙碱对DRG神经元TRPV4介导的Ca2+内流的影响DRG神经元负载Fluo-3/AM后,观察细胞内游离Ca2+图像,比较给予秋水仙碱后细胞的荧光强度值的变化。结果显示：在同一孵育时间,细胞内[Ca2+]i随秋水仙碱剂量增加而减少,秋水仙碱对DRG神经元TRPV4介导的[Ca2+]i的影响在0.01～0.1ug/ml范围内呈现剂量依赖关系。与对照组相比,0.01、0.05、0.1ug/ml秋水仙碱可使DRG神经元TRPV4介导的荧光强度变化值即时减少11.7%(P>0.05),23.5%(P>0.05)和60.8%(P<0.001)。因此,0.1ug/ml秋水仙碱可以明显降低4α-PDD引起的细胞内Ca2+浓度的增加(P<0.001)。4.秋水仙碱对CCD大鼠DRG神经元TRPV4介导的Ca2+内流的影响CCD大鼠DRG神经元负载Fluo-3/AM后,观察细胞内游离Ca2+图像,比较加0.1ug/ml秋水仙碱后细胞的荧光强度值的变化。结果显示,秋水仙碱可以明显降低4a-PDD引起的细胞内Ca2+浓度的增加。结论微管对CCD大鼠DRG神经元TRPV4的功能具有调节作用。