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金黄色葡萄球菌是引起化脓性疾病的重要病原菌,广泛存在于自然界中,其产生的肠毒素是世界范围内引起食物中毒的重要原因之一。在多种不同血清型肠毒素中,以A型肠毒素引起食物中毒的发生率最高,因此,建立灵敏、快速的金黄色葡萄球菌A型肠毒素(Staphylococcal aureus enterotoxinsA,SEA)的检测方法,是进行食品安全检测、预防食物中毒的必要条件。此外,采用抗SEA单克隆抗体,能够有效地提高检测的灵敏度和特异性。为了适应基础研究的需要,探索出SEA的快速检测方法,本研究借助南京诺唯赞生物科技有限公司以及南京诺唯赞医疗科技有限公司提供的平台,制备了抗SEA单克隆抗体,并研发出用于定量检测SEA的量子点荧光检测试剂盒。该技术用量子点作为示踪物质,代替了传统荧光标记物,具有快速、灵敏、可进行定量检测的优点。本研究主要包括抗金黄色葡萄球菌A型肠毒素单克隆抗体的制备,量子点荧光检测试剂盒的研发以及试剂盒最终性能的确认。主要研究内容如下:首先,以重组SEA蛋白为抗原,对Balb/c小鼠进行了免疫,间接ELISA法检测免疫小鼠血清效价,血清效价在6400以上。通过体内大量诱生腹水法制备单克隆抗体,最终得到2C2和7B5两株单克隆抗体,两株抗体都具有特异性识别A型肠毒素的能力,且两株抗体类型均为IgG1亚类,采用间接竞争法ELISA来检测两株单克隆抗体的效价,抗体2C2效价为5.12×106,抗体7B5效价为2.56×106。另外,通过间接竞争法ELISA、免疫印迹法对单抗的特异性进行了评估,结果显示两株抗体特异性好。其次,以抗SEA单克隆抗体偶联量子点结合免疫层析技术研发SEA检测试剂盒,去提高试剂盒的灵敏度和抗干扰能力。本实验部分主要对试剂盒制备工艺进行优化,优化过程中确定了 C线包被羊抗鼠二抗浓度为1.5 mg/mL,T线包被抗体7B5浓度为0.5 mg/mL,量子点和稀释液的稀释比例为1:50,NC膜选用Millipore HFC 90作为最佳包被载体。以添加1%的蔗糖的缓冲液作为包被缓冲液,标记物稀释液中BSA的添加量为0.5%,样品垫处理液中添加1%的蔗糖和Casein。最后,对试剂盒的基本性能进行了验证和确认,其中,试剂盒分析灵敏度为1.0 ng/mL;线性范围在1.0-100 ng/mL,线性范围广;用试剂盒检测不同浓度不同类型肠毒素的标准品,无明显交叉反应,特异性良好;对SEA标准品溶液的高值和低值进行重复性测试,求得的变异系数(CV值)均在5%以内,试剂盒精密性良好;以2-8℃储存条件作为对照组,对试剂盒进行为期20天的37℃加速稳定性考察,试剂盒变异系数在15%以内,稳定性良好;将试剂盒应用于食品样品的检测,对试剂盒进行加样回收实验,测得牛奶中SEA的平均回收率为95.7%,回收率范围在60%-120%之间,试剂盒检测结果准确可靠。