糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白CD160是一个 27 kDa 糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族，其基因定位于人染色体1q21.1。CD160最早发现于具有细胞毒活性的细胞表面，有一个IgV样结构域，由于剪接拼接的不同，CD160有四种异构体，之前的研究都是针对于传统的GPI-CD160。CD160的mRNA和蛋白在人CD56dimCD16+NK细胞，NKT细胞，肠上皮内淋巴细胞（IEL）高表达，而在B细胞和脊细胞中不表达。组织中，CD160在脾、小肠、外周血淋巴细胞中表达较高，而在脑、肝、心、胸腺等表达较低。在NK细胞上，CD160也能广泛的识别经典和非经典的MHCⅠ类分子，并在免疫应答中起到正向刺激的作用。同时，CD160跨家族结合HVEM，抑制CD4+T细胞的增殖和细胞因子的分泌，并且降低CD3ζ链的磷酸化，产生新的共抑制信号途径，在免疫应答中起到负向抑制的作用。由于这一新的共抑制信号途径发现较晚，CD160在许多疾病中的作用尚未可知。本研究旨在克隆人CD160基因，并建立CD160的转基因细胞株，研制抗人CD160的单克隆抗体，为进一步的工作奠定物质基础。　　 　　 第一部分 人CD160基因的克隆、基因转染细胞株的建立及其生物学功能的初步研究　　 　　 目的：克隆人CD160编码区基因，构建含有人CD160基因的重组载体，获得稳定表达基因的转基因细胞，并验证其是否具有功能性。　　 方法：从人外周血cDNA文库中扩增出了CD160的基因，并克隆入pMD19-T载体，另以VSIG4基因的cDNA为模板扩增跨膜区基因。将T载体和跨膜区基因双酶切后回收的两个基因片段装入pIRES2-EGFP载体，转染L929细胞。经G418筛选出稳定表达CD160分子的转基因细胞株，并命名为L929/CD160TMV。采用流式细胞仪等分析鉴定CD160分子的表达，并分析其和L929/HVEM共培养后的结合情况。　　 结果：成功克隆出了CD160的基因，构建了含人CD160基因的重组载体，筛选并获得稳定表达人CD160分子的转基因细胞L929/CD160TMV。初步检测该转基因细胞能结合L929/HVEM转基因细胞，证明其功能性。　　 结论：成功建立了可稳定表达人CD160分子的基因转染细胞，为研制抗人CD160单克隆抗体提供了有效的免疫原。　　 　　 第二部分 抗人CD160单克隆抗体的研制　　 　　 目的：研制鼠抗人CD160单克隆抗体，为探讨CD160/HVEM相互作用对T细胞免疫应答的影响提供手段。　　 方法：以表达人CD160分子的基因转染细胞L929/CD160TMV为免疫原，常规免疫BALB/c小鼠，利用B淋巴细胞杂交瘤技术，将免疫小鼠脾脏和骨髓瘤细胞株SP2/0融合，并以转基因细胞L929/CD160TMV和L929/mock分别作为阳性和阴性筛选细胞进行筛选。采用间接免疫荧光标记法流式细胞仪检测、反复筛选和多次克隆化培养，获得特异性分泌鼠抗人CD160分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株；采用Ig亚型快速定性试纸法，Dot-Blot和位点竞争结合抑制等实验，对获得的杂交瘤细胞株和单克隆抗体进行鉴定。　　 结果：成功获得1株持续稳定分泌鼠抗CD160单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为3E2，经Ig亚型快速定性试纸分析显示，其重链为IgG1亚类，轻链则为κ链。Dot-Blot鉴定分析,3E2能与L929/CD160TMV细胞裂解液反应，而不与L929，L929/mock细胞裂解液反应。竞争结合抑制实验显示,3E2和商品化抗体识别不同抗原表位，不产生竞争作用。　　 结论：成功获得1株稳定分泌特异性鼠抗人CD160单抗的杂交瘤细胞株，且与商品化抗体识别不同抗原表位，从而为研究CD160/HVEM共抑制信号对T细胞的抑制性调节提供手段。　　 综上所述，本课题成功建立了可稳定表达人CD160分子的基因转染细胞，为研制抗人CD160单克隆抗体提供了有效地免疫原并成功获得1株稳定分泌特异性鼠抗人CD160单抗的杂交瘤细胞株，与商品化抗体识别不同抗原表位，为研究CD160/HVEM共抑制信号对T细胞免疫应答的影响提供手段。