研究背景:　　 蚊媒传染病流行范围广,传播力强,发病率高,全球每年有上亿人感染疟疾、登革热等蚊媒病,死亡人数过百万。我国已知蚊类18个属、371个种和亚种,涵盖疟疾、登革热、乙型脑炎、丝虫病的主要媒介。中国疾病预防控制中心报告显示我国仅2006年疟疾发病就超过6万例,疫情出现回升,流行性乙型脑炎在近年也出现局部爆发。总之,蚊媒传染病的流行严重危害人类生命健康,影响社会的稳定,阻碍经济的发展。媒介蚊虫防治是控制蚊媒传染病流行的重要措施。目前,对于登革热、黄热病、西尼罗病毒病等蚊媒病毒传染病尚无特效治疗方法或特异性预防手段,而疟原虫对传统药物抗药性也逐渐凸显,媒介控制在预防其发生和流行方面的重要性就显得更加突出,而寻求有效的控制方法则成为世界医学界面临的重要课题。媒介化学防治由于其突出的效果在蚊媒防治中一度占有统治地位,但是随着传统上的化学防治所造成的严重环境污染,及蚊虫耐药性的产生等弊端的日益显现,蚊虫的生物防治愈来愈受到人们的青睐。生物防治主要应用蚊虫病原体、寄生物、捕食物来达到防治效果,或通过转基因蚊作为控制的措施,这就要求对蚊虫病原体基因组有更好的了解及寻找新的防治策略。　　 近年随着RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术的不断发展,不仅成为昆虫基因组功能研究的有力工具,而且开始在害虫防治上崭露头角,如通过饲喂表达dsRNA的作物或食物来沉默特定基因进而控制害虫,这为害虫防治领域开辟了一个新的途径。由此可以想象在蚊虫的生物防治策略上RNAi将会有很大的发展空间。但是RNAi在蚊虫防治应用上却存在一个重要的瓶颈--就是如何更有效的将RNAi序列注入到细胞中或蚊虫体内。因此,要想应用在昆虫基因组研究及蚊媒防治上,就需要一种更有效的传递机制。　　 浓核病毒(Densovirus,DNV)属自主性的细小病毒,主要感染昆虫纲与甲壳纲的非脊索动物。目前,浓核病毒亚科主要划分为四属即:浓核病毒属(Deflsovirus)、短浓核病毒属(Brevidensovirus)、黑胸大蠊浓核病毒属(Pefudensovirus)、相对病毒属(Iteravirus)、同时还包括一些暂时未归类的浓核病毒。蚊浓核病毒(Mosquito densoviruses,MDV)属短浓核病毒属,主要包括埃及伊蚊浓核病毒(Aeries aegypti densovirus,AaeDNV))等目前共分离得到16株。可特异性的感染蚊类。MDV在外界相对稳定,宿主特异性强仅仅感染蚊类,可通过水平传播与垂直传播方式在蚊种群内扩散。MDV基因组相对简单,属小分子DNA病毒,基因组长大约4000nt左右,由左侧的非结构蛋白NS1、NS2编码区与右侧的结构蛋白VP编码区(分别由p7、p60启动子启动),以及两端的重复序列(Inverted repeat sequences,IRS)组成。其全基因组在亚克隆入质粒载体转染蚊细胞后,可在细胞内表达早期蛋白NS1,通过早期蛋白识别两侧IRS并通过自身酶的作用将全基因组从载体上脱离,并回复野生性状。这些特点使MDV在基因工程中具有安全,便于操作等优势,使其具有发展为RNAi病毒载体巨大的潜在价值。　　 本研究通过基因工程方法用可以示踪的GFP蛋白基因代替AaeDNV VP蛋白基因,并在NS与GFP之间插入人工内含子,在内含子构建以蚊虫PutativeU6snRNA polymerase Ⅲ(PolⅢ)promoter为启动子表达的siRNA表达框,来构建重组蚊浓核病毒干扰载体。靶基因选择的是蚊虫空泡ATP酶(Vacuolar ATPase,V-ATPase),V-ATP-ase不仅维持蚊虫正常生理功能还与疟原虫等病原体入侵蚊体内息息相关。最终将检测重组病毒载体及重组病毒颗粒在蚊C6/36细胞系与白纹伊蚊幼虫体内的干扰效果并对白蚊伊蚊实验室株的致死效果进行初步测试。　　 人工内含子可以自主剪切,靶基因干扰序列表达框随内含子剪切而不会影响外显子的作用,不会造成蛋白改变。另外内含子片段很小,而插入的RNAi编码框整体也很小,如果这种含有内含子的编码框插入到野生病毒的VP或NS蛋白编码框内,重组病毒的基因组长度不会影响其包装效率,而最终使得重组的可自我复制型病毒成为可能,也为我们下一步将基于RNAi的重组病毒发展为生物杀虫剂打下了基础。　　 目的:构建基于人工内含子内插入干扰序列表达框的重组AeaDNV干扰载体。验证人工内含子在昆虫细胞内是否可以正常剪切,内含子内的RNAi干扰载体是否能在白纹伊蚊C6/36细胞内与白纹伊蚊幼虫体内干扰相应靶基因V-ATPase,检测抑制效果。初步测试重组病毒的杀蚊效果。并为最终发展可自我复制重组蚊浓核病毒奠定基础。　　 方法:根据白纹伊蚊V-ATPase的序列人工合成3对SiRNA序列使用lipofectamin 2000转染C6/36细胞,以β-actin为内参,real-timePCR法筛选对V-ATPase有较高抑制效果的siRNA序列。绿色荧光蛋白GFP作为报告基因连接到AaeDNV的非结构蛋白NSl基因编码区C端,构建成质粒载体pNSl-GFP,以NSl-GFP融合蛋白的形式,以病毒p7启动子启动表达。应用基因重叠延伸拼接PCR法(Gene splicing by overlapping extension PCR,SOE PCR)获得人工内含子全序列。人工内含子5-端剪接点(供位)序列来自人类β-球蛋白基因第一内含子,3’-端剪接点(受位)序列来自免疫球蛋白重链可变区基因内含子,并在中间引入MluI与NheI限制性酶切位点以便插入靶基因干扰序列表达框。在两端加入AgeI限制性酶切位点,将人工内含子加入到NSl-GFP融合蛋白编码框位于NSl编码区与GFP编码区之间。人工合成冈比亚按蚊与埃及伊蚊Putative U6snRNApolymerase Ⅲ(PolⅢ)启动子,分别以两种启动子,三种siRNA序列构建6种shRNA表达框:P 1/P2+SiRNA(SenSe)+LOOP(tcaagag)+SiRNA(antisense)+Terminator(tttttttt),插入到人工内含子内相应酶切位点,构建成6种重组病毒RNAi载体质粒。将6种质粒转染C6/36细胞,分别于转染后12、24、48、60、96 h,real-timePCR检测目的基因的表达量。分别以上各重组病毒载体以pUCA载体为辅助载体共转染C6/36细胞,获得重组病毒后感染白纹伊蚊一期幼虫进行体内抑制实验,感染后5天分别筛选不同感染度的白纹伊蚊幼虫,提取RNA,real-time PCR检测目的基因抑制效果。通过不同时间点计数病毒感染组幼蚊的死亡数目来测定重组AaeDNV的致死效应。　　 结果:成功的构建了靶基因V-ATPase的重组AeaDNV RNAi载体。(1)shRNA表达元件插入到内含子内,以内含子内表达框的形式进行表达,插入部位外显子NS-GFP基因表达融合蛋白未受影响,证明人工内含子可以在昆虫细胞内正常剪切。(2)重组载体的报告分子GFP有助于我们对shRNA转染和表达水平进行监测。(3)有效干扰序列的重组载体质粒或对应重组病毒在C6/36细胞和白纹伊蚊一期幼虫内对目的基因都有明显的抑制效果,实验组的目的基因表达率明显降低与对照组相比差异显著(P<0.05)。(4)埃及伊蚊Putative U6snRNApolymerase Ⅲ(PolⅢ)启动子所启动表达的shRNA无论在白纹伊蚊细胞系中还是在活体中比冈比亚按蚊Putative U6snRNA polymeraseⅢ(PolⅢ)启动子都起到了更好的靶基因抑制效果。(5)实验室条件下重组病毒对白纹伊蚊有较好的致死率。　　 结论:首次以病毒直接感染的方式对蚊虫进行了RNAi研究。以人工内含子中插入目的基因干扰序列表达框的策略构建了重组蚊浓核病毒干扰载体,为蚊功能基因组学研究与发展以RNAi为基础的可自我复制的重组蚊浓核病毒杀虫剂提供了理论和实验依据。