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肠炎沙门菌(Salmonella enterica serovar Enteritidis, S. Enteritidis, SE)是革兰阴性兼性胞内寄生菌,主要寄生在人和动物的肠道中,能引起畜禽及人类的沙门菌病,具有重要的公共卫生意义。疫苗接种是目前控制人和动物沙门菌病的有效措施之一。由SPI-1和SPI-2编码的Ⅲ型分泌系统(type III secretion/translocation system, T3SS)是沙门菌致病的重要毒力因子,近年来通过基因工程技术,将病原菌相关毒力基因敲除,构建沙门菌减毒活疫苗的研究备受关注。但是,目前以T3SS SPI-1编码的效应蛋白基因sopE2和sptP作为沙门菌减毒的靶基因研究还未见报道。本研究分别将肠炎沙门菌C50336株SPI-1 T3SS毒力相关基因敲除,构建了基因缺失株C50336ΔsopE2和C50336ΔsptP,对其生物学特性进行了鉴定,并且对缺失株C50336Asp/P的免疫生物学特性做了评价。一、肠炎沙门菌sopE2与sptP基因缺失株的构建及其生物学特性鉴定利用分子生物学技术构建了重组原核表达质粒pET30a-SopE2, pET32a-SptP,导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3),通过IPTG诱导,成功表达了重组蛋白rHis-SopE2、rHis-SptP, SDS-PAGE显示重组蛋白均以可溶性的形式表达,以纯化后的两种重组蛋白分别制备了多克隆抗体。利用λ-Red同源重组系统对肠炎沙门菌sopE2与sptP基因进行敲除,成功构建了肠炎沙门菌缺失株C50336△sopE2和C50336△sptP,并通过重组质粒PBR322成功构建回复株C50336△sopE2::sopE2和C50336△sptP::sptP。Real time-PCR与Western blotting分析结果均表明基因缺失与回复成功。对两株缺失株的生长、生化特性以及对小鼠的毒力鉴定。结果表明,两缺失株生长和生化特性与野生株无显著差异：C50336AsopE2对小鼠的LD50与野生株相比没有显著变化,而C50336△sptP比野生株的LDso至少升高100倍,这为后期研究其作为减毒肠炎沙门菌活疫苗的可能性奠定了重要基础。二、肠炎沙门菌C50336△sptP的免疫生物学特性研究以鼠源巨噬细胞RAW264.7和人源结肠癌上皮细胞Caco-2为细胞模型,比较缺失株C50336AsptP与野生株C50336的黏附、侵袭和增殖能力。结果发现,与野生株相比,该缺失株对RAW264.7细胞的侵袭和早期增殖能力均显著下降(p<0.05)；同时,缺失株对Caco-2上皮细胞的侵袭能力也显著弱于野生株(p<0.05)。为评价C50336AsptP减毒后的安全性,以剂量为1×107 CFU和1×108 CFUC50336 AsptP分别免疫小鼠,连续观察21天,测定其在小鼠肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结(mLN)、盲肠及粪便内的定植情况。研究发现在免疫后的21天,1×107CFU免疫组小鼠各脏器中的细菌均已基本被清除；1×108CFU免疫组仅有1只小鼠肝脏、脾脏、mLN中仍携带有少量细菌。所有免疫后的小鼠从第3天开始直至21天盲肠与粪便中均已无细菌的定植。同时,从免疫后小鼠体重增长的监测结果显来看,缺失株的免疫对小鼠体重的增长没有显著影响。为进一步测定缺失株在小鼠体内引起的免疫应答规律,以剂量为1×107CFU和1×108CFUC50336△sptP分别对小鼠进行免疫并在两周后二免,对照组用PBS以相同方式进行免疫,检测血清IgG抗体和亚型分泌水平以及淋巴细胞的增殖效果。结果显示缺失株免疫后能诱导小鼠产生良好的体液免疫应答和细胞免疫应答。以野生株C50336对二免后两周的小鼠进行攻毒,以评价C50336AsptP对小鼠的免疫保护。结果显示强毒株攻毒后1×108 CFU免疫组的免疫保护率为100%,1×107CFU免疫组的免疫保护效率为62.5%,而对照组仅为25%。同时,通过对攻毒后存活小鼠的肝脏、脾脏及盲肠中细菌分离情况发现免疫组大部分小鼠体内已基本不带菌,而对照组的小鼠体内仍携带大量细菌。这说明免疫了C50336AsptP后能有助于小鼠对强毒株的清除。