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背景与目的:肝纤维化（liver fibrosis）是各种病因引起肝损伤后修复与重构的可逆性的过程,持续发展会导致肝硬化、肝癌的发生,严重威胁人类健康。虽经有效抗病毒治疗可以部分逆转肝纤维化,但其他病因所导致的肝纤维化,临床上仍无广泛有效的抗纤维化药物。由于“肝-肠轴”的存在,肝脏内异常的代谢反应可以造成肠道微生态破坏,同时紊乱的肠道功能加速肝纤维化的进展。鉴于肝纤维化的可逆性,研究肝纤维化的发生发展机制及探究抗肝纤维化药物具有十分重要意义。传统中药熊果酸（Ursolic acid,UA）具有保护肝细胞、抑制肝脏炎症及抗纤维化等作用,被认可为抗肝纤维化的潜力药物,但其逆转肝纤维化的作用及具体机制有待明确。本研究旨在探讨UA在肝纤维化发生及进程中的治疗作用及其分子生物学机制。材料与方法:（一）研究UA对小鼠肝纤维化发生及进程的影响1.构建CCl4诱导肝纤维化小鼠模型及UA治疗:野生型C57BL/6雄性小鼠随机分为3组:Control组、CCl4组、UA治疗组,其中Control组给予1ml/kg橄榄油腹腔注射8周,2次/周;CCl4组给予1ml/kg CCl4（橄榄油稀释20%）腹腔注射8周,2次/周;UA组给予1ml/kg CCl4（橄榄油稀释20%）腹腔注射8周,2次/周,后2周给予UA（50mg/kg/d）灌胃,7次/周。造模8周结束后,禁食3天,获取血、肝脏等标本。2.构建HFD诱导肝纤维化小鼠模型及UA治疗:野生型C57BL/6雄性小鼠随机分为3组:LFD组、HFD组、UA治疗组,过渡饮食1周后,LFD组给予LFD饲料自由饮食24周;HFD组给予HFD饲料自由饮食24周;UA组给予HFD饲料自由饮食24周,后6周给予UA（50mg/kg/d）灌胃,3次/周。造模24周结束后,禁食3天,获取血、肝脏等标本。3.构建MCD诱导肝纤维化小鼠模型及UA治疗:野生型C57BL/6雄性小鼠随机分为3组:MCS组、MCD组、UA治疗组,过渡饮食1周后,MCS组给予MCS饲料自由饮食8周;MCD组给予MCD饲料自由饮食8周;UA组给予MCD饲料自由饮食8周,后2周给予UA（50mg/kg/d）灌胃,7次/周。造模8周结束后,禁食3天,获取血、肝脏等标本。4.分子生物学检测:ELISA法检测小鼠血清的ALT、AST、羟脯氨酸、甘油三酯;GTT、ITT试验检测小鼠葡萄糖耐量及胰岛素耐量;肝脏HE染色、Masson染色、天狼星红染色、油红O染色检测肝脏组织结构、胶原沉积、脂质沉积等;免疫组织化学、免疫组织荧光、实时荧光定量PCR（q PCR）、免疫印迹法（Western blot,WB）检测肝纤维化相关基因（α-SMA、Collagen-I、TIMP-1）、肝细胞凋亡。（二）研究UA对肝纤维化小鼠的肠道菌组成、肠屏障功能的影响1.微生物多样性:留取CCl4造模与MCD造模及相应UA治疗后小鼠的肠道组织（分组处理同前）,对肠道内容物进行16S r RNA肠道菌测序分析。经过DNA抽提、PCR扩增、Illumina Miseq测序和数据分析得出数据,进行α多样性、β多样性、肠道菌组成和LEf Se分析筛选关键菌属等分析,观察UA是否调控肠道菌影响肝纤维化进程。2.肠屏障功能检测:HE染色用于观察回肠组织病理改变;ELISA法检测小鼠血清的LPS水平;免疫组织荧光、q PCR、WB检测肠紧密连接蛋白（Occludin,Claudin-1）的表达。3.肠道去污的肝纤维化小鼠模型:入室适应1周后,混合抗生素水饮用2周后（阿莫西林1g/L、万古霉素0.5g/L、新霉素1g/L、甲硝唑1g/L）,随机分为3组:Control组、CCl4组、UA治疗组,CCl4造模过程同前;入室适应1周后,混合抗生素水饮用2周后（阿莫西林1g/L、万古霉素0.5g/L、新霉素1g/L、甲硝唑1g/L）,随机分为3组:Control组、MCD组、UA组,MCD造模过程同前。4.分子生物学检测:ELISA法检测小鼠血清的ALT、AST、羟脯氨酸、甘油三酯;肝脏HE染色、Masson染色、天狼星红染色、油红O染色检测肝脏组织结构、胶原沉积、脂质沉积等;免疫组织化学、免疫组织荧光、q PCR、WB检测肝纤维化相关基因（α-SMA、Collagen-I、TIMP-1）、肝细胞凋亡。（三）研究UA对肝BAs谱的影响1.胆汁酸定量测定:留取CCl4造模与MCD造模及相应UA治疗后小鼠的肝脏组织（分组处理同前）,对肝脏进行靶向胆汁酸谱的UPLS-MS测序。经过标准品配制、UPLS-MS和数据分析得到胆汁酸的绝对定量,进行主成分分析（PCA）、OPLS-DA差异代谢物筛选,观察UA是否调控肝脏胆汁酸谱影响肝纤维化进程。2.肠道菌与胆汁酸的联合分析:采用Pearson相关性,计算微生物相应等级的丰度与对应代谢物的相关性。（四）研究UA调节肝脏NOX4/NLRP3炎症小体信号通路1.基于NOX4-/-小鼠构建CCl4诱导肝纤维化模型及UA治疗:野生型C57BL/6雄性小鼠随机分为2组:CCl4组、CCl4+AP组,CCl4组给予1ml/kg CCl4（橄榄油稀释20%）腹腔注射8周,2次/周;CCl4+AP组给予1ml/kg CCl4（橄榄油稀释20%）腹腔注射8周,2次/周,后2周给予AP（50mg/kg/d）灌胃,7次/周;NOX-/-小鼠的C57BL/6雄性小鼠随机分为2组:NOX4-/-+CCl4组、NOX4-/-+CCl4+UA组,处理同前,造模结束后,禁食3天,获取血、肝脏、肠道内容物等标本。2.基于NLRP3/-小鼠构建CCl4诱导肝纤维化模型及UA治疗:野生型C57BL/6雄性小鼠给予1ml/kg CCl4（橄榄油稀释20%）腹腔注射8周,2次/周;NLRP3-/-小鼠的C57BL/6雄性小鼠随机分为2组:NLRP3-/-+CCl4组、NLRP3-/-+CCl4+UA组,处理同前,造模结束后,禁食3天,获取血、肝脏、肠道内容物等标本。3.分子生物学检测:ELISA法检测小鼠血清的ALT、AST、羟脯氨酸;肝脏HE染色、Masson染色、天狼星红染色检测肝脏组织结构、胶原沉积等;免疫组织化学、q PCR、WB检测肝纤维化相关基因（α-SMA、Collagen-I、TIMP-1）、NOX4、NLRP3炎症小体等。结果:（一）UA治疗可逆转小鼠肝纤维化发生发展1.成功构建CCl4腹腔注射诱导肝纤维化小鼠及验证UA治疗效果:给予UA治疗2周后,相对于CCl4组,UA组小鼠肝脏损伤、胶原沉积及肝细胞凋亡明显减轻,ALT、AST、羟脯氨酸明显下降,a-SMA、Collagen-I、TIMP-1等肝纤维化相关基因表达明显下降。2.成功构建HFD饮食诱导肝纤维化小鼠及验证UA治疗效果:给予UA治疗6周后,相对于HFD组,UA组小鼠体重明显减轻,葡萄糖耐量与胰岛素耐量改善,肝脏损伤、胶原沉积及脂质沉积明显减轻,ALT、AST、羟脯氨酸明显下降,a-SMA、Collagen-I、TIMP-1等肝纤维化相关基因表达明显下降。3.成功构建MCD饮食诱导肝纤维化小鼠及验证UA治疗效果:给予UA治疗2周后,相对于MCD组,UA组小鼠体重增加,肝脏损伤、胶原沉积及脂质沉积明显减轻,ALT、AST、羟脯氨酸明显下降,α-SMA、Collagen-I、TIMP-1等肝纤维化相关基因表达明显下降。（二）UA对肝纤维化小鼠的肠道菌组成、肠屏障功能的影响1.UA对CCl4腹腔注射诱导肝纤维化小鼠的肠道菌组成、肠屏障功能的影响:肠道内容物多样性测序结果显示:相对于CCl4组,UA组小鼠的α多样性明显升高,β多样性显示明显组间差异,微生物群物种组成明显改变,门水平表现为Firmicutes菌门增多和Proteobacteria菌门减少,属水平表现为Akkermansia、Helicobacter、Bacteroide等菌属减少和Lactobacillus、Parabacteroides等菌属增多;回肠肠屏障功能结果:相对于CCl4组,UA组小鼠的回肠组织结构稍有改善,血清LPS水平下降,Occludin、Claudin-1的表达明显升高;经肠道去污的预处理,相较于CCl4+ABx组,CCl4+UA+ABx组小鼠ALT、AST、羟脯氨酸无明显变化,肝脏损伤和胶原沉积物明显改变。2.UA对MCD饮食诱导肝纤维化小鼠的肠道菌组成、肠屏障功能的影响:肠道内容物多样性测序结果显示:相对于MCD组,UA组小鼠的α多样性明显升高,β多样性显示明显组间差异,微生物群物种组成明显改变,门水平表现为Firmicutes菌门增多和Proteobacteria菌门减少,属水平表现为Akkermansia、Staphylococcus、Bacteroide等菌属减少和Lactobacillus、Parabacteroides等菌属增多;回肠肠屏障功能结果:相对于MCD组,UA组小鼠的回肠组织结构稍有改善,血清LPS水平下降,Occludin、Claudin-1的表达明显升高;经肠道去污的预处理,相较于MCD+ABx组,MCD+UA+ABx组小鼠ALT、AST、羟脯氨酸无明显变化,肝脏损伤和胶原沉积物明显改变。（三）熊果酸对肝BAs谱的影响1.UA对CCl4腹腔注射诱导肝纤维化小鼠肝脏胆汁酸的影响与联合分析:肝脏胆汁酸谱测序结果显示:相对于CCl4组,UA组小鼠肝脏胆汁酸组成明显改变,去氧胆酸（Deoxycholic Acid,DCA）、胆酸（Cholic Acid,CA）、牛磺脱氧胆酸（Taurodeoxycholic Acid,TDCA）明显减低,且DCA与Bacteroide、Akkermansia、Helicobacter等显著性正相关,TDCA与Bacteroide、Akkermansia等显著性正相关,DCA与Lactobacillus、Parabacteroides显著性负相关。2.UA对MCD饮食诱导肝纤维化小鼠肝脏胆汁酸的影响与联合分析:肝脏胆汁酸谱测序结果显示:相对于MCD组,UA组小鼠肝脏胆汁酸组成明显改变,DCA、CA、TCA、TDCA等明显减低,UDCA等明显增高,且DCA与Bacteroide、Akkermansia、Helicobacter显著性正相关,TDCA与Akkermansia、Helicobacter显著性正相关,UDCA与Lactobacillus、Parabacteroides显著性正相关,DCA与Lactobacillus、Parabacteroides显著性负相关。（四）熊果酸调节肝脏NOX4/NLRP3炎症小体信号通路1.UA抑制CCl4诱导肝纤维化小鼠的NOX4和NLRP3炎症小体表达:免疫组化、q PCR和WB结果显示,相对于Control组,CCl4组的NOX4和NLRP3炎症小体的表达上调;相对于CCl4组,UA组的NOX4和NLRP3炎症小体的表达下调。2.抑制NLRP3炎症小体可有效缓解肝纤维化:构建了NLRP3-/-小鼠,给予CCl4腹腔注射及UA处理。与WT+CCl4组相比,NLRP3-/-+CCl4组小鼠肝脏组织内炎症细胞浸润减少,胶原沉积明显减少,ALT、AST、羟脯氨酸明显下降,a-SMA、Collagen-I、TIMP-1等肝纤维化相关基因表达明显下降;与NLRP3-/-+CCl4组相比,NLRP3-/-+CCl4+UA组小鼠上述的改变无明显差异。3.抑制NOX4可有效缓解肝纤维化:构建了NOX4-/-小鼠,给予CCl4腹腔注射及UA或NOX4抑制剂（AP）处理。与WT+CCl4组相比,NOX4-/-+CCl4组、WT+AP组小鼠肝脏组织内炎症细胞浸润减少,胶原沉积明显减少,ALT、AST、羟脯氨酸明显下降,a-SMA、Collagen-I、TIMP-1等肝纤维化相关基因表达明显下降;与NOX4-/-+CCl4组相比,NOX4-/-+CCl4+UA组小鼠上述的改变无明显差异。4.NOX4可有效刺激了NLRP3炎症小体表达:q PCR和WB结果显示,相较于WT+CCl4组小鼠,NLRP3-/-+CCl4组的NOX4的表达无显著变化;相较于WT+CCl4组小鼠,NOX4-/-+CCl4组、NOX4-/-+CCl4+UA组、WT+AP组,NLRP3炎症小体的表达均明显降低。5.NOX4/NLRP3炎症小体信号通路对CCl4诱导肝纤维化小鼠肠道菌的影响:肠道内容物多样性测序结果显示:相对于WT+CCl4组,NLRP3-/-+CCl4组、NOX4-/-+CCl4组小鼠的α多样性明显升高,β多样性显示明显组间差异,微生物群物种组成明显改变,门水平表现为Firmicutes菌门增多和Proteobacteria菌门减少,属水平表现为Akkermansia等菌属明显减少,Lactobacillus等菌属明显增加。结论:1.UA对多种方式诱导小鼠的肝纤维化进展有明显治疗意义,肝功能损伤下降,胶原沉积减少,肝纤维化相关基因表达下降。2.肠道菌改变在小鼠肝纤维化进程中扮演重要作用,常伴有肠屏障功能改变,且UA逆转肝纤维化有赖于肠道菌的调控。3.胆汁酸谱改变参与小鼠肝纤维化进程及UA逆转肝纤维化的调控,且与肠道菌的改变密切相关。4.NOX4/NLRP3炎症小体信号通路是肝纤维化进展与UA逆转肝纤维化的重要机制,且与肠道菌调控密切相关。