白血病是造血系统的恶性肿瘤,发病率在各种人类肿瘤中占第六位,居年轻人恶性疾病的首位,是一种严重威胁人类生命健康的恶性疾病,努力寻找天然、高效的防治药物以预防和治疗白血病,是一项具有重要的现实和理论意义的研究课题。植物黄酮是膳食中一类较为重要的植物化学物,具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等广泛、优良的生物学效应,特别是对于肿瘤的发生、增殖、迁移、侵袭、血管生成以及耐药性等各阶段、各方面都具有显著的抑制作用,植物黄酮抗肿瘤研究一直是国内外研究的一个热点。本课题组前期研究选用23种分子结构明确的常见植物黄酮,对其抗肿瘤效应进行了评价和筛选,结果显示,3,6-二羟黄酮和2’-羟基二氢黄酮具有较强的抗肿瘤效应,其抗肿瘤作用及其机制值得深入探讨,本课题是在此研究基础上的进一步深入。肿瘤细胞最显著的特点是不受控制的快速增殖特性,能够有效抑制肿瘤细胞的增殖是抗肿瘤作用的最基本表现。细胞存活率,即活细胞的比例,反映出该群细胞的整体增殖活力状况,细胞存活率越高反映出该群细胞的增殖活性越好,反之则表明该群细胞中的死亡细胞、凋亡细胞比例高,细胞整体增殖活性低。细胞凋亡是以细胞核浓缩、染色体DNA被以核小体为单位切成梯状片段、细胞缩小,最终形成细胞凋亡小体等形态变化为特征。研究表明,细胞凋亡发生的关键环节在于线粒体膜功能发生改变,内膜跨膜电位消失和线粒体内蛋白酶活化物(如细胞色素C)的释放,激发各种凋亡相关的代谢变化,从而启动凋亡程序。线粒体跨膜电位消失与细胞色素C从线粒体的释放被认为是细胞凋亡启动的关键步骤:释放到细胞浆的细胞色素C在dATP存在的条件下激活caspase家族,从而启动和执行凋亡信号转导。细胞中抗氧化酶系统的功能对于调控活性氧(ROS)以及调节包括增殖、凋亡、炎症反应的细胞生命活动具有极其重要的作用。肿瘤细胞内的抗氧化酶活性都显著低于正常细胞,肿瘤细胞清除ROS和生成GSH的能力较低,而肿瘤细胞内的ROS水平往往高于正常细胞,降低细胞内抗氧化酶活性能够选择性杀伤肿瘤细胞,这可能是抗肿瘤药物发挥效应的重要机制。促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信号通路是真核生物信号传递网络中的重要途径之一,在基因表达调控和细胞质功能活动中发挥关键作用。近年来一些研究表明,ROS和氧化应激可介导MAPKs信号途径的改变,诱导细胞凋亡,其中JNK/SAPK和p38MAPK两条途径在氧化应激的研究中引起广泛关注。前期研究表明3,6-二羟黄酮可显著影响HL-60细胞胞内ROS水平,3,6-二羟黄酮是否因此影响MAPK信号通路,值得探讨。基于以上分析,本课题选用前期药效实验筛选出的具有较强抗肿瘤效应的3,6-二羟黄酮和2’-羟基二氢黄酮,观察两种植物黄酮化合物对白血病HL-60细胞增殖和凋亡的影响,利用流式细胞分析、激光共聚焦扫描显微镜、Western blot等分子生物学检测分析技术,检测3,6-二羟黄酮对HL-60细胞线粒体膜电位水平降低、细胞色素C释放以及caspase家族激活这一凋亡启动和执行信号转导的影响,同时探讨3,6-二羟黄酮诱导HL-60细胞凋亡过程中,对细胞抗氧化酶活性和MAPKs信号通路的影响。本研究主要实验结果和结论如下:1.细胞生长曲线结果显示,不同剂量的3,6-二羟黄酮和2’-羟基二氢黄酮作用于HL-60细胞,细胞增殖能力产生不同程度降低,显示出浓度-依赖性和时间-依赖性效应关系;10μM浓度的3,6-二羟黄酮和20μM的2’-羟基二氢黄酮能够有效抑制HL-60细胞的快速增殖,20μM以上浓度的3,6-二羟黄酮则可有效阻止HL-60细胞的增殖,显示出杀灭HL-60细胞的抗肿瘤活性。与此一致,细胞活力分析结果表明,3,6-二羟黄酮和2’-羟基二氢黄酮能够剂量、时间-依赖性的降低HL-60细胞的细胞活力。以上结果表明,3,6-二羟黄酮和2’-羟基二氢黄酮能够显著降低HL-60细胞的细胞活力,抑制其增殖。2.细胞形态学观察可见,正常HL-60细胞生长状态良好,形态完整,细胞呈珍珠(圆球)形,悬浮生长,细胞排列紧密,大小均匀,组织完整,未见破裂细胞和细胞碎片;3,6-二羟黄酮和2’-羟基二氢黄酮处理24h后,HL-60细胞形态随处理剂量的增加逐渐呈现出显著异常,表现为细胞排列稀疏、紊乱,大小不均匀,形态异常,大量细胞皱缩变圆、胞质凝缩或肿大破裂,肿胀细胞、破裂细胞和细胞碎片逐渐增多,这些形态变化都是凋亡细胞或死亡细胞的表现特征。这表明,3,6-二羟黄酮和2’-羟基二氢黄酮作用HL-60细胞后,细胞中死亡细胞、凋亡细胞和细胞碎片大量增加。3.流式细胞凋亡分析结果表明,20μM的3,6-二羟黄酮和2’-羟基二氢黄酮处理,能够显著诱导HL-60细胞发生凋亡,凋亡细胞比例显著增高,显示出良好的抗肿瘤效应。进一步研究表明,20μM的3,6-二羟黄酮作用于HL-60细胞,细胞线粒体膜电位水平随作用时间增加而逐渐降低,并在作用8 h后显著低于正常对照组水平;Western blot方法检测胞浆蛋白中细胞色素C的含量,结果表明,20μM的3,6-二羟黄酮作用后2 h即见细胞胞浆中的细胞色素C含量显著升高,并随作用时间的增加逐渐增高;这表明3,6-二羟黄酮可诱导HL-60细胞线粒体膜电位显著降低,并导致线粒体中的细胞色素C大量释放至胞浆,启动细胞凋亡。4.细胞抗氧化酶活性检测结果显示,3,6-二羟黄酮可显著降低HL-60细胞胞内抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的活性,并显著降低SOD的表达,细胞中脂质过氧化物MDA水平显著升高。表明3,6-二羟黄酮可通过降低胞内抗氧化酶活性增加HL-60细胞内的氧化应激压力,导致细胞过氧化损伤。5. Western blot检测结果表明,正常对照组HL-60细胞中caspases基本以无活性的酶原状态形式存在,裂解活化的caspases(cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9和cleaved-PARP)水平很低,3,6-二羟黄酮作用后,细胞中caspase 3、caspase 9、PARP含量逐渐降低,cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9和cleaved-PARP水平逐渐增高,cleaved-caspases/caspase的比值增高,表明caspases和PARP被裂解活化,凋亡启动和执行的信号转导被显著激活,细胞进入凋亡程序。6. Western blot检测结果表明,20μM 3,6-二羟黄酮作用于HL-60细胞,细胞内MAPKs信号通路蛋白表达及磷酸化水平发生显著变化,细胞质内磷酸化ERK在处理2 h后显著下降,至24 h恢复到正常水平;JNK与p38MAPK则表现为磷酸化蛋白水平增高,在处理2 h后,磷酸化蛋白含量显著增加,然后缓慢下降,但24 h内仍高于正常水平,提示3,6-二羟黄酮对JNK、p38MAPK信号通路的影响较大。综上所述,本研究结果表明,3,6-二羟黄酮和2’-羟基二氢黄酮能够有效抑制白血病HL-60细胞增殖,降低HL-60细胞增殖活力,并显著诱导HL-60细胞凋亡;进一步研究表明,3,6-二羟黄酮可显著降低HL-60细胞胞内抗氧化酶系统活性,使细胞过氧化损伤产物显著增加,同时降低线粒体膜电位水平,导致细胞色素C大量释放,激活caspases凋亡启动和执行信号转导,而此过程与MAPKs信号通路的变化可能具有相关性。