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研究背景和研究目的：慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)是一种以持续气流受限为特征的可以预防和治疗的常见呼吸系统疾病,其气流受限多呈进行性发展,引起COPD急性加重的主要原因是下呼吸道反复感染,其中流感嗜血杆菌是COPD急性加重的主要病原菌之一。不可分型流感嗜血杆菌是多形的G-杆菌,是上呼吸道常见的定植菌。NTHi侵入下呼吸道后会损害气道黏膜纤毛清除能力,造成气道粘液分泌增加和上皮受损。这些病理改变可以加速细菌在呼吸道的定植和感染,造成肺实质损伤和进行性小气道阻塞,从而促进COPD的发生发展。巨噬细胞在病原微生物与衰老细胞的清除、促进炎症反应、诱发适应性免疫反应及损伤组织的重构与修复过程中起着关键作用。巨噬细胞在不同微环境的作用下可分为两种类型：M1和M2型。M1型巨噬细胞分泌大量的炎症因子,并能够高效递呈抗原,激活Thl细胞反应,具有抗病原微生物和肿瘤细胞的作用。M2型巨噬细胞杀菌能力比较弱,具有抑制Thl细胞免疫反应,促进损伤组织修复、重构和血管生长的功能。然而COPD患者中肺泡巨噬细胞吞噬细菌以及分泌细胞因子的功能都受到严重紊乱,清除细菌能力受损。因此阐明NTHi感染后肺部炎症反应和细菌清除的细胞和分子机制,将为NTHi感染相关疾病预防和控制、临床治疗策略等提供新的思路,也可为新型药物研制提供分子靶标。蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2(Src homology phosphotyrosyl phosphatase2)是蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase, PTP)家族成员之一,由PTPN11基因编码并在人类细胞和组织中广泛表达,参与调控多种胞内转导信号通路。而且SHP2与呼吸系统疾病关系密切,参与调控多种呼吸系统疾病的发生发展。然而,目前SHP2基因对肺部细菌感染后急性炎症的影响及其相关分子调控机制仍未得到深入的阐明。因此,我们将通过建立骨髓来源巨噬细胞和髓系细胞SHP2基因定向敲除小鼠NTHi感染模型,探索SHP2基因及其相关信号通路在巨噬细胞炎症反应和细菌清除中的作用。我们的研究有助于阐明SHP2在调控巨噬细胞分化以及增强机体抗菌免疫的分子机制,为肺部细菌感染的免疫学治疗提供新的策略。研究方法体内试验1.建立急性肺NTHi感染模型：C57/BL6小鼠通过气道滴注NTHi (1×107CFU/40μL)的方法建立肺部感染模型,分别于NTHi感染6h,12h,24h收集肺组织检测IL-6,TNF-a等炎症因子的表达,同时检测SHP2的表达情况。C57/BL6小鼠在NTHi感染前30分钟腹腔注射SHP2特异性抑制剂PHPS1(3mg/kg),感染结束后肺组织做病理学检查镜下观察PHPS1处理后小鼠炎症反应的变化,同时收集小鼠肺组织抽提RNA检测炎症介质的表达,收集肺泡灌洗液检测炎症因子水平,明确PHPS1对NTHi所致肺部炎症反应的影响。2.构建髓系细胞SHP2基因敲除鼠动物感染模型：使用Cre-loxP技术实现髓系细胞SHP2基因定向敲除,SHP2flox/flox小鼠与LysMcre+小鼠交配后可以得到髓系细胞定向敲除SHP2小鼠SHP2Δ/Δ(基因表型LysMcre+/SHP2flox/flox),同时得到的LysMcr+和SHP2flox/flox小鼠作为同窝对照小鼠,气道滴注NTHi (1×107CFU/40μL)后,肺组织病理切片观察肺组织炎性反应。收集肺组织检测细菌负荷及炎性介质的变化。体外实验1.提取C57/BL6小鼠的骨髓来源的巨噬细胞(BMDM):小鼠骨髓细胞体外经C-MSF诱导分化为BMDM细胞,NTHi感染后检测细胞SHP2的表达情况。PHPS1预处理BMDM后,加入NTHi刺激,检测巨噬细胞表型变化,巨噬细胞吞噬作用及其杀菌作用。观察PHPS1对巨噬细胞功能的影响。分离LysMcre+/SHP2flox/flox来源的BMDM,检测NTHi感染后巨噬细胞表型变化,明确SHP2在巨噬细胞分化中的作用。2. NTHi刺激髓系细胞敲除SHP2鼠来源的BMDM后,检测STAT1,STAT6, AKT, p65磷酸化水平,阐明SHP2参与巨噬细胞表型转化的信号通路。结果1. NTHi感染C57/BL6小鼠12h后,SHP2基因表达的升高,TNF-a,IL-6,MIP-2等炎症介质表达水平显著增高,肺部病理切片显示肺泡结构遭到破坏,肺泡间隔微血管充血水肿,并伴有大量炎性细胞浸润。2.抑制SHP2可以有效减弱NTHi诱导的肺部炎症反应。小鼠腹腔注射PHPS1可以抑制肺组织产生IL-6,TNF-a炎症因子,减少肺组织炎症细胞浸润。3.C57BL/6小鼠BMDM感染NTHi后,SHP2基因水平和蛋白水平表达均有显著升高。PHPS1抑制SHP2后,可以抑制NTHi感染后M1型巨噬细胞的分化,同时促进NTHi感染后M2型巨噬细胞表面标记物YM-1,ARG的表达。并且PHPS1削弱了巨噬细胞的杀菌能力。4.SHP2敲除鼠SHP2Δ/Δ感染NTHi后,肺组织炎性细胞浸润减少,肺组织和肺泡灌洗液中细菌负荷升高,SHP2Δ/Δ来源的巨噬细胞感染NTHi后,巨噬细胞M1标记物表达降低,而细胞M2标记物YM-1表达增高。5.敲除BMDM中的SHP2基因,显著下调NTHi诱导的p-65NF-κB磷酸化。提示SHP2可能通过调节p-65磷酸化活性,来调节NF-κB信号通路,从而抑制了细菌诱导的巨噬细胞炎症反应。结论研究发现SHP2参与调控了NTHi诱导的肺部炎症反应和肺部细菌清除。SHP2可能通过调节P65-NF-KB信号通路调控巨噬细胞炎症反应。抑制SHP2可以减弱M1型巨噬细胞的分化,削弱巨噬细胞杀菌功能。