【摘 要】
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2019年12月以来,由新型冠状病毒（SARS-Co V-2）引起的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）在全球持续蔓延,给全球公共卫生安全带来了巨大的挑战。SARS-Co V-2的快速传播主要由于以下两个方面:一是无症状感染者和潜伏期患者也具有传染性,二是具有更强传染性的突变株不断出现。SARS-Co V-2的早期诊断是有效预防和控制COVID-19疫情发展的重要手段。因此,建立一种简便、快速、灵
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2019年12月以来,由新型冠状病毒（SARS-Co V-2）引起的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）在全球持续蔓延,给全球公共卫生安全带来了巨大的挑战。SARS-Co V-2的快速传播主要由于以下两个方面:一是无症状感染者和潜伏期患者也具有传染性,二是具有更强传染性的突变株不断出现。SARS-Co V-2的早期诊断是有效预防和控制COVID-19疫情发展的重要手段。因此,建立一种简便、快速、灵敏、有效的SARS-Co V-2检测方法是非常亟需的。环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）因其操作简单、反应快速、灵敏度高等特点被广泛用于各种传染病病原的即时检测（point-of-care testing,POCT）。自COVID-19疫情爆发后,已有至少19套LAMP引物被设计并用于建立SARSCo V-2逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测方法。然而,LAMP存在频繁的非特异性扩增、难以实现单管多重检测、容易漏检高变异靶标等问题,限制了其在临床检测中的应用。为解决以上问题,本研究将高保真DNA聚合酶及其介导的荧光探针与LAMP体系相结合,建立了一种基于探针法的耐突变、多重荧光RT-LAMP检测方法。该方法与传统的LAMP相比:1)提高了检测的特异性,克服了LAMP检测中非特异扩增的不足;2)实现了LAMP的单管多重检测,并能够进行核酸免提取多重RT-LAMP反应;3)实现了LAMP对突变序列检测的广谱性,适用于高变异病毒的广谱检测。并进一步地将该方法运用于SARS-Co V-2的检测中。具体研究内容如下:（1）为了筛选出高效的LAMP引物或引物组合用于SARS-Co V-2的快速检测,本研究先用4段体外转录的RNA标准品和29份COVID-19阳性临床样本对已发表的19套引物进行了系统性的比较评估。从整体的检测效果来看,分别位于SARS-Co V-2基因组ORF1ab,S,S,E,N以及N基因区域的引物4,10,11,13,14和17表现出较好的检测效果,其中引物4阳性检测率最高（82.8%）,并且检测限低至3拷贝/反应。推荐将引物4和另外4套引物（引物14,10,11,13）中的任意一套相结合建立RT-LAMP检测实验用于COVID-19监测中。（2）根据引物评估结果,本研究选取引物4（位于ORF1ab基因）以及引物13（位于E基因）,同时结合人管家基因β-actin作为内参,建立了SARS-Co V-2耐突变、多重RT-LAMP检测法。该方法能够在20 min内同时检测低至30拷贝/反应的ORF1ab和E基因的RNA。用190份鼻咽拭子样本进行临床评估,该SARS-Co V-2多重RT-LAMP检测方法与商业化的RT-q PCR试剂盒检测结果相比,具有较高的灵敏度（94.5%）、特异性（100%）和一致性（96.8%）,同时也证明了其能够有效检测alpha、delta等SARS-Co V-2突变株。此外,为了更好的用于POCT诊断,本研究进一步建立了SARS-Co V-2核酸免提取多重RT-LAMP,并用49份SARS-Co V-2阳性鼻咽拭子样本进行了检测效果的验证。该核酸免提取多重RT-LAMP法无需样本核酸提取,只需要一个简单的加热块,结合一个蓝光透照仪,45 min内即可完成从采样到结果的可视化读取,能够广泛用于社区或居家检测。本研究建立的新型耐突变、多重荧光RT-LAMP检测法不仅能用于SARSCo V-2的检测,也完全适用于其他导致大多数新发、再发传染性疾病的高变异RNA病毒（比如寨卡、流感病毒等）低成本,高灵敏的单管多重检测。
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