论文部分内容阅读
毕赤酵母(Pichia pastoris,P.pastoris)表达系统不但具有原核表达系统的各种特点和优势,又拥有真核生物蛋白翻译后加工修饰的功能(如N-糖基化),因此被广泛应用于重组蛋白的表达。但是,毕赤酵母表达产生的是高甘露糖型糖链,与人和哺乳动物表达产生的复杂型糖链的差别非常大。高甘露糖型糖链会使得糖蛋白的免疫原性增强,这是毕赤酵母不能用于绝大部分糖蛋白药物生产的主要限制因素。由于高甘露糖型糖链存在这一缺陷,所以我们拟对毕赤酵母的N-糖基化途径进行基因工程改造。在前期的工作中,本实验室已经获得了α-1,6-甘露糖转移酶(OCH1)单突变型P.pastoris X33菌株与α-1,6-甘露糖转移酶(OCH1)和α-1,3-甘露糖转移酶(ALG3)双突变型P.pastoris X33菌株。但是双突变菌株生长状况比较差,不利于进一步的改造。本论文通过诱导突变的方法对双突变型菌株进行优化育种,获得生长状况有所改善的菌株。同时,引入α-1,2-甘露糖苷酶(MNS?)基因,拟进一步切除甘露糖,得到P.pastoris X33(MNS?)。在P.pastoris X33毕赤酵母菌株中表达报告糖蛋白GM-CSF,获得人源化的核心糖蛋白。本研究通过紫外诱变方法与ARTP(常压室温等离子体)诱变方法对双缺陷型菌株进行诱变育种。每次紫外诱变将酵母菌悬液稀释到1000个?m L-1,诱变后涂板,避光培养。每次ARTP诱变将酵母菌悬液调节到OD 6-8,诱变后十倍梯度稀释,涂板培养。经过三轮紫外诱变和一轮ARTP诱变后,大量正向诱变菌株被获得。再对这些正向诱变菌株进行二十轮富集筛选后,获得了一株生长状况有所改善的P.pastoris X33诱变菌株。以诱变菌株为研究对象,合成酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)MNS?基因的内质网定位序列和线虫(Caenorhabditis elegans)α-1,2-甘露糖转移酶(MNS?)基因的催化序列相融合的基因,再整合到毕赤酵母表达载体p GAPZB上,获得MNS?导入载体p GAPZB-MNS?。Avr II酶单酶切载体使线性化,电转导入诱变菌株,以博来霉素(Zeocin)为筛选标志,获得了P.pastoris X33(MNS?)菌株。构建P.pastoris X33(MNS?)菌株表达糖蛋白GM-CSF系统,用SDS-PAGE和western blot方法对P.pastoris X33野生菌、P.pastoris X33单突变菌、P.pastoris X33双突变菌和P.pastoris X33(MNS?)菌表达GM-CSF的情况进行研究分析,结果发现P.pastoris X33(MNS?)菌株表达的GM-CSF分子量比其他菌株都低。经过PNGase F酶切后,P.pastoris X33(MNS?)菌和野生菌的GM-CSF分子量均降到20 KD以下,说明这两株菌发生了不同程度的糖基化。但是,P.pastoris X33(MNS?)菌株的表达量依然非常低,即使在超滤浓缩500倍之后。