悬浮红细胞是应用最为广泛的一种血液制品,红细胞输注已成为提高患者血液运氧能力,改善机体组织缺氧状态的一种重要临床治疗手段。但随着储存时间的延长,红细胞会发生一系列生物代谢与结构的改变,如细胞内各种成分逐渐降解,携氧能力、变形能力减弱,这些改变统称为“储存损伤”（storage lesions）。临床研究表明:输注“储存损伤”的悬浮红细胞,可能导致患者出现严重的输血后并发症,增加患者的死亡率。红细胞膜是维持红细胞正常结构和功能的关键,膜内含有大量重要的功能蛋白、结构蛋白和活性蛋白。红细胞膜的性状是决定红细胞输入体内能否存活的重要因素。课题组已有研究证实:红细胞膜随储存时间的延长,结构会被破坏,红细胞膨胀,体积增大。因此,红细胞膜结构和功能的改变是“储存损伤”的重要内容。氧化应激是导致“储存损伤”主要机制之一:红细胞富含血红蛋白,在储存过程中,血红蛋白不断发生自动氧化,产生大量活性氧族（reactive oxygen pecies:ROS）。ROS可氧化红细胞膜内的脂质、活性蛋白、结构蛋白,改变细胞膜的结构和功能,甚至引起细胞死亡。虾青素（astaxanthin,ASTA）是目前自然界发现的强效抗氧化剂之一,其含有的羟基、共轭双键、酮基等集团可向自由基提供电子,淬灭单形态氧,快速结束过氧化反应。研究发现:ASTA可降低神经系统、心血管系统、缺血再灌注损伤等疾病发生时的氧化应激水平,且未发现明显副作用。本研究采用抗氧化剂ASTA处理悬浮红细胞,观察ASTA对悬浮红细胞内ROS含量,细胞超微结构、细胞膜过氧化损伤程度以及细胞膜重要蛋白酶超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、Na⁺-K⁺-ATPase、Ca²⁺-ATPase活性的影响。目的:本研究在悬浮红细胞保养液内加入抗氧化剂ASTA,储存第7天、28天时观察悬浮红细胞内氧化应激水平,细胞膜过氧化损伤程度、细胞超微结构、细胞膜蛋白酶SOD、Na⁺-K⁺-ATPase、Ca²⁺-ATPase活性,探讨抗氧化剂ASTA能否通过降低悬浮红细胞内氧化应激水平,改善细胞膜过氧化损伤程度,提高SOD、Na⁺-K⁺-ATPase、Ca²⁺-ATPase活性,减轻红细胞超微结构改变。方法:1悬浮红细胞的制备及分组处理采集6名健康献血者血液制备成悬浮红细胞作为实验标本。取悬浮红细胞血袋一个,采用无菌接口机将其分装到两个空血袋内,并将其随机分为对照组和ASTA组。无菌操作台内,采用一次性注射器将二甲基亚砜溶解的ASTA加到ASTA组血袋内,轻轻颠倒混匀,使ASTA均匀分布,终浓度为10μmol/L。对照组只加入等量的二甲基亚砜溶剂。对照组和ASTA组红细胞再次分装到2个空血袋内,最后各组悬浮红细胞均置于2℃-6℃冰箱内保存。分别于贮存的第7天、28天收集细胞外液和红细胞,进行相关指标检测。2测定指标及方法2.1悬浮红细胞超微结构的改变0.5ml悬浮红细胞,1000rpm,离心1分钟,去上清,生理盐水重复洗涤三次后,1%戊二醛室温固定10min去上清,加三蒸水室温静置5min洗涤悬浮红细胞,然后去上清,重复洗涤两次。经梯度乙醇脱水,真空干燥,镀金,S—3500N日立扫描电子显微镜观察悬浮红细胞超微结构的改变,并随机选取4个视野计数双凹圆盘状红细胞和棘状红细胞,计算其比例平均值（%）。2.2悬浮红细胞内ROS含量的检测按照ROS检测试剂盒操作说明,将DCFH-DA（1:1000生理盐水稀释）加入到生理盐水洗涤的悬浮红细胞内,于37℃细胞培养箱内孵育,待反应终止后采用等体积RIPA细胞裂解液裂解红细胞。采用荧光酶标仪测定裂解产物内的荧光值。同时,血红蛋白测定试剂盒测定红细胞裂解液内的血红蛋白含量,采用红细胞裂解液内荧光值与血红蛋白含量之比表示悬浮红细胞内ROS含量。2.3悬浮红细胞外游离血红素（free hemoglobin,FHb）的检测收集2 ml储存悬浮红细胞,3000 rpm 4℃离心10 min,收集上清,用于FHb检测。悬浮红细胞外FHb含量采用化学比色法测定。2.4悬浮红细胞膜的提取悬浮红细胞1ml,500 rpm,4℃离心5分钟,弃上清。红细胞沉淀内加入3倍体积生理盐水洗涤红细胞,500 rpm,4℃离心5分钟,弃上清,如此洗涤三次。向红细胞内加入40倍体积的磷酸钠缓冲液（5 mmol/L,PH8.0）,剧烈震荡使之溶血。将溶血物于4℃、20000 rpm离心40分钟,白色沉淀部分即为红细胞膜。红细胞膜采用等体积磷酸钠缓冲液洗涤两次,再次收集红细胞膜沉淀,生理盐水稀释,-70℃冰箱保存备用。2.5悬浮红细胞膜丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量测定悬浮红细胞膜MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法测定,检测过程按试剂盒操作说明进行。2.6悬浮红细胞膜SOD活性测定悬浮红细胞膜SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法测定,检测过程按试剂盒操作说明进行。2.7悬浮红细胞膜Na⁺-K⁺-ATPase活性测定悬浮红细胞膜Na⁺-K⁺-ATPase活性采用比色法测定,检测过程按试剂盒操作说明进行。2.8悬浮红细胞膜Ca²⁺-ATPase活性测定悬浮红细胞膜Ca²⁺-ATPase活性采用比色法测定,检测过程按试剂盒操作说明进行。2.9悬浮红细胞膜SOD活性、Na⁺-K⁺-ATPase活性、Ca²⁺-ATPase活性与红细胞膜MDA含量、细胞内ROS含量的相关性分析。悬浮红细胞膜SOD活性、Na⁺-K⁺-ATPase活性、Ca²⁺-ATPase活性与红细胞膜MDA含量、细胞内ROS含量的相关性采用Pearson相关分析。结果:1.悬浮红细胞超微结构的改变扫描电镜下可见:储存7天时,对照组大多数红细胞呈双凹圆盘状,但凹陷变浅,红细胞肿胀,边缘出现圆顿的隆起,少部分细胞出现棘状隆起（棘刺）;虾青素组红细胞凹陷明显,肿胀较对照组轻,边缘也有圆顿隆起,个别细胞呈棘状,棘形红细胞数少于对照组（P<0.01）。储存28天时,对照组悬浮红细胞大量呈棘形,且棘刺突出明显,虾青素组棘形红细胞明显少于对照组（P<0.05）,可见部分双凹圆盘状红细胞。2.悬浮红细胞内ROS含量（荧光强度/mg Hb）储存7天时,对照组悬浮红细胞内ROS含量为204.26±28.69,虾青素组为148.13±5.49,虾青素组ROS含量明显低于对照组（P<0.01）;储存28天时,对照组悬浮红细胞内ROS含量为274.98±27.2,虾青素组为183.63±16.08,虾青素组ROS含量明显低于对照组（P<0.01）。3.悬浮红细胞外FHb含量储存7天时,对照组悬浮红细胞外FHb含量为52.77±5.35 mg/L,虾青素组为36.13±5.59 mg/L,虾青素组FHb含量明显低于对照组（P<0.01）;储存28天时,对照组悬浮红细胞外FHb含量为148.82±5.81 mg/L,虾青素组为96.13±11.85 mg/L,虾青素组FHb含量明显低于对照组（P<0.01）。4.悬浮红细胞膜MDA含量储存7天时,对照组悬浮红细胞膜MDA含量为25.61±3.88mmol/g,虾青素组为10.78±1.68mmol/g,虾青素组MDA含量明显低于对照组（P<0.01）;储存28天时,对照组悬浮红细胞膜MDA含量为52.65±7.38mmol/g,虾青素组为31.09±4.59mmol/g,虾青素组MDA含量明显低于对照组（P<0.01）。5.悬浮红细胞膜SOD活性储存7天时,对照组悬浮红细胞膜SOD活性为0.62±0.08U/mg pro,虾青素组1.02±0.16U/mg pro,虾青素组SOD活性明显高于对照组（P<0.01）;储存28天时,对照组悬浮红细胞膜SOD活性为0.32±0.05U/mg pro,虾青素组为0.65±0.10U/mg pro,虾青素组SOD活性明显高于对照组（P<0.01）。6.悬浮红细胞膜Na⁺-K⁺-ATPase活性储存7天时,对照组悬浮红细胞膜Na⁺-K⁺-ATPase活性为3.65±0.64mmol/mg pro·h,虾青素组为4.56±0.68mmol/mg pro·h,虾青素组Na⁺-K⁺-ATPase活性明显高于对照组（P<0.05）;储存28天时,对照组悬浮红细胞膜Na⁺-K⁺-ATPase活性为2.51±0.36mmol/mg pro·h,虾青素组为3.35±0.45mmol/mg pro·h,虾青素组Na⁺-K⁺-ATPase活性明显高于对照组（P<0.01）。7.悬浮红细胞膜Ca²⁺-ATPase活性储存7天时,对照组悬浮红细胞膜Ca²⁺-ATPase活性为6.25±0.79 mmol/mg pro·h,虾青素组为7.78±0.99 mmol/mg pro·h,虾青素组Ca²⁺-ATPase活性明显高于对照组（P<0.05）;储存28天时,对照组悬浮红细胞膜Ca²⁺-ATPase活性为4.39±0.58 mmol/mg pro·h,虾青素组为5.92±0.78 mmol/mg pro·h,虾青素组Ca²⁺-ATPase活性明显高于对照组（P<0.01）。8.悬浮红细胞膜SOD活性、Na⁺-K⁺-ATPase活性、Ca²⁺-ATPase活性与红细胞膜MDA含量、细胞内ROS含量的相关性悬浮红细胞膜SOD活性、Na⁺-K⁺-ATPase活性、Ca²⁺-ATPase活性与红细胞膜MDA含量、细胞内ROS含量均呈负相关关系。结论:1.虾青素可降低储存悬浮红细胞内氧化应激水平,减轻细胞膜过氧化损伤程度和超微结构改变。2.虾青素可提高悬浮红细胞胞膜SOD、Na⁺-K⁺-ATPase、Ca²⁺-ATPase活性,延缓细胞膜重要蛋白酶活性的降低。