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一、研究背景和目的背景:难治性慢性创面的迁延不愈常与细菌生物膜相关,而其中最为常见的是金黄色葡萄球菌生物膜和铜绿假单胞菌生物膜,细菌生物膜通过胞外基质、微环境适应、细胞膜上的外排泵、群体感应系统、存留细胞以及水平基因转移等分子机制对抗菌药物产生耐药性或形成耐受,因此常规治疗通常无法有效清除生物膜。寻找生物膜敏感的药物是目前面临的主要挑战。金黄色葡萄球菌生物膜的胞外多糖聚N-乙酰葡糖胺(PNAG)可在细菌周围形成一层带正电荷的扩散屏障来限制抗生素的渗透,而PNAG抗体在体内可介导补体沉积、多形核中性粒细胞协助的受感染巨噬细胞凋亡、干扰素释放来杀灭细胞内病原体。在众多抗生素中,达托霉素在抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成上表现出色,但普通的剂型不能规避生物膜的耐药性和耐受机制。脂质体则可提高负载的抗生素或抗真菌药物的抗微生物效能,同时具备良好的生物相容性,有望成为抗生物膜的药物传递载体。目的:构建体外金黄色葡萄球菌生物膜模型,验证金黄色葡萄球菌生物膜中PNAG的存在,制备达托霉素脂质体,比较达托霉素不同剂型对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用,进一步分析达托霉素脂质体联合PNAG抗体对金黄色葡萄球菌生物膜形成及活性的影响。二、方法在96孔或24孔培养板上建立静态的金黄色葡萄球菌生物膜模型,扫描电镜观察培养24h及48h生物膜形态,在不同时刻对其胞外多糖进行麦胚凝集素染色,在倒置荧光显微镜下观察PNAG形成过程。微量肉汤稀释法测定达托霉素和万古霉素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度,结晶紫半定量检测达托霉素和万古霉素对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用,选择对生物膜抑制作用更强的抗生素进行脂质体包被。薄膜分散法制备达托霉素脂质体,测定其表征、包封率及载药量。结晶紫半定量检测比较达托霉素不同剂型对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用,活菌计数法评价PNAG抗体、达托霉素脂质体联合PNAG抗体对生物膜的抑制作用。以PNAG抗体、达托霉素溶液、达托霉素脂质体及单纯培养基为对照组,以达托霉素脂质体联合PNAG抗体为实验组,用麦胚凝集素染色生物膜中的PNAG探究不同处理因素对生物膜胞外多糖形成的作用,使用细菌生物膜活性试剂盒评价不同处理因素作用下生物膜的活性。三、结果(1)扫描电镜观察到金黄色葡萄球菌生物膜中细菌互相连结、团聚的形态,倒置荧光显微镜可观察到24h内生物膜中的PNAG从散在点状分布到凝集成片状的过程,提示早期生物膜形成。(2)药物敏感性试验结果提示达托霉素溶液和万古霉素溶液对浮游状态的金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度均为1μg/mL。(3)本实验中达托霉素脂质体的平均粒径为(107.9±53.14)nm,平均Zeta电位为(-14.9±8.01)mV,其包封率为(87.41±0.45)%,载药量为(5.46±0.28)%。(4)结晶紫半定量检测试验结果提示在药物浓度相同时,达托霉素脂质体对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用最强,达托霉索溶液次之,万古霉素溶液最弱。(5)活菌计数法结果提示培养基对照组中活菌数为(6.28±1.31)×109CFU/mL,单独的PNAG抗体处理组中活菌数为(4.62±1.46)×109CFU/mL,达托霉素脂质体联合PNAG抗体处理组中活菌数为(2,22士0.66)×107CFU/mL,单独的PNAG抗体处理组与对照组在体外对金黄色葡萄球菌生物膜活性的作用无明显统计学差异(p>0.05)。(6)麦胚凝集素染色结果表明,与其他对照组相比,PNAG抗体组的生物膜胞外基质分散呈大块碎片状,达托霉素脂质体联合PNAG抗体组的生物膜胞外基质显著减少,分布更稀疏;生物膜活性试剂盒染色结果表明,与其他对照组相比,达托霉素脂质体联合PNAG抗体组的金黄色葡萄球菌生物膜发出强烈的红色荧光,可见徽弱的绿色荧光,提示大部分细菌为死细菌,只有少数细菌存活。四、结论本研究构建了静态金黄色葡萄球菌生物膜模型并观察其胞外多糖的形成过程及特征;验证了与万古霉素溶液相比,达托霉素溶液可对金黄色葡萄球菌生物膜的形成产生更强的抑制作用;为增强达托霉素的抗生物膜作用,本研究制备了达托霉素脂质体,并验证了与达托霉素溶液相比,达托霉素脂质体可对生物膜的形成产生更强的抑制作用;本研究进而设计了 PNAG抗体与达托霉素脂质体联用方案,并发现二者联用可有效杀灭细菌,对金黄色葡萄球菌生物膜形成及活性产生协同抑制作用,提示该联合用药方案有望为细菌生物膜的治疗提供新的思路。